ARTÍCULO ORIGINAL
Aislamiento e identificación de Gluconacetobacter
diazotrophicus a partir de variedades de caña
de azúcar cultivadas en Cuba
Isolation and identification of Gluconacetobacter diazotrophicus from sugarcane varieties growing in Cuba
Marcia Rojas, Julia Manzano y Mayra Heydrich
Departamento de Microbiología, Facultad de Biología,
Universidad de La Habana
* Autor para correspondencia:
marcia@fbio.uh.cu
Resumen
La caña de azúcar constituye uno de los
principales cultivos agrícolas para nuestro país y tiene gran importancia,
desde los puntos de vista económico y ecológico, a nivel mundial. La presencia
de Gluconacetobacter diazotrophicus
en diferentes cultivos de interés económico en el mundo sugiere que esta
especie establece una interacción beneficiosa. La potencialidad de los
microorganismos endófitos para su uso en la agricultura es muy promisoria, por
lo cual la detección de la especie Gluconacetobacter
diazotrophicus resulta fundamental para su futura
utilización. En este trabajo se estudiaron 18 variedades de caña de azúcar
cultivadas en Cuba mediante el aislamiento de la bacteria endófita G. diazotrophicus. Se detectó la presencia de esta especie
en 13de las variedades sobre la base de las características micromorfológicas
y culturales de los aislados obtenidos. Por primera vez se demostró la
presencia del endófito en las variedades Cuba 1616-75, Cuba 751-75, Campos
Brasil 44-52 y SP701143 cultivadas en Cuba. Se seleccionaron 46 aislados
provenientes de las variedades Jaronú 60-5, Cuba
323-68 y Media Luna 318 y se identificaron mediante pruebas fisiológicas y
bioquímicas como pertenecientes a la especie en estudio.
Palabras
clave: Gluconacetobacter diazotrophicus,
caña de azúcar, aislamientos, identificación
ABSTRACT
Sugarcane is one of the most important commercial
crops in Cuba and other countries in the world. The worldwide occurrence of G. diazotrophicus in
sugarcane and other plants suggest a beneficial association between this
species and grass species. The potentialities of endophytes
in the agricultural biotechnology are very high, that is why the detection of
this bacterium inside of sugarcane is so important. The aim of this work was to
detect the occurrence of Gluconacetobacter diazotrophicusin 18 varieties of sugarcane
growing in Cuba. This species was isolated in 13 varieties on the basis of micromorphological and colonies characteristics. For the first
time it was isolated G. diazotrophicus from
varieties Cuba 1616-75, Cuba 751-75, Campos Brasil
44-52 and SP701143 cultivated in Cuba. The 46 isolates from the varieties Jaronú 60-5, Cuba 323-68 and Media Luna 318 were identified
as G. diazotrophicus by morphological and
biochemical test.
Keywords: Gluconacetobacter
diazotrophicus, sugarcane,
isolation, identification
Recibido:
2008-09-23
Aceptado:
2008-12-20
Introducción
Existen varias alternativas para el desarrollo de sistemas agrícolas
que usan los microorganismos. Entre las principales acciones beneficiosas de
las bacterias se incluyen la producción de hormonas promotoras del crecimiento
(Sturz et al., 1998), la solubilización
de minerales, la fijación de nitrógeno (Gaskins et
al., 1984) y el control de patógenos (Mari et al., 1996). Por su
gran importancia, se ha previsto la utilización de los microorganismos
endófitos en diferentes agroecosistemas.
A finales de los años ochenta se aisló de la caña de azúcar la especie
acetobacter diazotrophicus,
actualmente Gluconacetobacter diazotrophicus (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Gillis et
al., 1989). Esta bacteria tiene la capacidad de fijar nitrógeno en
presencia de NO3- (10 mM), (Cavalcante
y Döbereiner, 1988) y produce sustancias estimuladoras
del crecimiento vegetal (Fuentes-Ramírezet
al., 1993). Además, G. diazotrophicus
pudiera utilizarse como control biológico de patógenos ya que se han realizado
experimentos in vitro demuestran que su potencialidad para inhibir el
crecimiento de los hongos Colletotrichum falcatum Went. (Muthukumarasamy et al., 2000) y la bacteria Xanthomonas albilineans
(Piñón et al., 2004). En Cuba, esta especie bacteriana se aisló a partir
de las variedades de caña de azúcar Jaronú 60-5 (Coego et al., 1992) y Media Luna 318 (Dong et al., 1994). Posteriormente se detectó su
presencia en algunas variedades procedentes de Banco de Semilla (Pérez et al.,
2001) y de otras de uso comercial (Ortega et al., 1996; 2002).
El presente
trabajo tiene como objetivo pesquisar la presencia de la especie Gluconacetobacter diazotrophicus
en variedades de caña de azúcar cultivadas en Cuba e identificar los aislados
con vistas a su utilización en el mejoramiento de cultivos agrícolas de
interés.
Materiales y métodos
En
este estudio fueron realizados aislamientos a partir de 18 variedades de caña
de azúcar (Saccharum sp.) utilizando dos métodos
diferentes (Cavalcante y Döbereiner,
1988; Dong et al., 1994). En ambos casos,
fueron sembrados en medio LGIP semisólido sin nitrógeno (Cavalcante
y Döbereiner, 1988). Los frascos fueron incubados
durante un periodo de siete a diez días a 30ºC.
A los aislados seleccionados les
fueron realizadas pruebas morfológicas y fisiológico-bioquímicas haciendo uso
de la cepa tipo de G. diazotrophicus PAl 5 (ATCC 49037) como patrón. Les fueron aplicadas las
pruebas descritas en el Manual de Bergey (De
Ley et al., 1984) y las específicas para esta especie señaladas por Cavalcante y Döbereiner (1988).
Para las observaciones de las células se empleó el microscopio electrónico de
transmisión mediante tinción negativa con acetato de uranilo.
Resultados
y discusión
Los
cultivos microbianos con características similares a G. diazotrophicus
en los frascos de medio LGI-P semisólido sin nitrógeno (144) mostraron, a
los siete días de incubación, un crecimiento en forma de película
amarillo-naranja en la superficie y un cambio en la coloración del medio.
Cuando se sembraron en placas Petri con este mismo
medio de cultivo, 117 aislados formaron colonias pequeñas, amarillo-naranja, de
bordes regulares, y en medio Papa-agar tomaron una
coloración carmelita. Estos aislados, además, respondieron negativamente a la
tinción de Gram, mostraron forma bacilar y no
formaron endosporas ni cápsulas, lo cual coincide con
las características descritas para la especie G. diazotrophicus
(Cavalcante y Döbereiner,
1988; Gillis et al., 1989). Los resultados de
las observaciones con el microscopio electrónico corroboraron la similitud
existente entre la morfología celular de todos los aislados y la cepa tipo PAl 5, así como la presencia de flagelación lateral o peritrica.
Estos
resultados demuestran que G. diazotrophicus se
encuentra presente en 13 de las 18 variedades de caña de azúcar estudiadas, de
las cuales se obtuvieron 117 aislados de la especie en este estudio. No se
encontró en las variedades Cuba 1751, Cuba 294-70, Jaronú
64-19, Cuba 8751 ni Cuba 120-78. En tal sentido, Pérez et al. (2001)
señalaron la falta de interacción entre estas dos últimas variedades y G. diazotrophicus, lo cual podría estar relacionado con la
capacidad de la caña de azúcar para seleccionar los endófitos mediante la unión
de los microorganismos con determinadas glicoproteínas solubles presentes en el
jugo (Legaz et al., 2000). Se demuestra por
primera vez la presencia de G. diazotrophicus
en las variedades Cuba 1616-75, Cuba 751-75, Campos Brasil 44-52 ySP701143
cultivadas en Cuba (figura 1).
Figura 1. Distribución de 117 aislados con características típicas de Gluconacetobacter diazotrophicus
encontrados en 13 variedades de caña de azúcar cultivadas en Cuba.
Figure
1.
Distribution of 117 isolates with tipical
characteristics of Gluconacetobacter diazotrophicus
found in 13 varieties of sugarcane growing in Cuba.
Tales
resultados coinciden con los obtenidos por Ortega et al. (1996), que
demostraron la presencia de G. diazotrophicus
en las variedades Canal Point 5243, Cuba 323-68 y Cuba 266-70.No ocurrió así
con las variedades Cuba 120-78 y Cuba 8751, lo cual pudo deberse a que las
plantas muestreadas no estaban cultivadas en la misma localidad y, por tanto,
estaban sometidas a condiciones ecológicas diferentes. Pérez et al.
(2001) obtuvieron resultados similares al trabajar con estas mismas variedades,
en las cuales el aislamiento de G. diazotrophicus
estaba influenciado por las condiciones edafoclimáticas.
Muñoz-Rojas
y Caballero-Mellado (2003) probaron que la relación entre G. diazotrophicus y la caña de azúcar depende del genotipo
de ambos organismos. Aunque coincidimos con el criterio delos mencionados
autores, consideramos que otros factores pueden influir sobre la interacción
entre la variedad de la planta y el genotipo de la bacteria, como pueden ser
las características del suelo, las condiciones climáticas, la edad del cultivo
y la fertilización nitrogenada. Se ha demostrado que la presencia de G. diazotrophicus en las plantas puede estar determinada
por el grado de fertilización nitrogenada a que estén sometidas las
plantaciones (Fuentes-Ramírez et al., 1993; Loganatan
et al., 1999), aspecto este último que también inhibe la colonización de
la planta por la bacteria (Fuentes-Ramírez et al., 1999).
Para
continuar con nuestro estudio se seleccionaron 46 aislados de tres variedades
de caña de azúcar teniendo en cuenta para los tres casos la alta frecuencia de
aparición de la bacteria estudiada. Además, las variedades Jaronú
60-5 y Cuba 323-68 han sido las más utilizadas en la producción azucarera en el
país durante los últimos cuarenta años (González et al., 2004) y la
variedad Media Luna 318 había sido cultivada durante más de diez años sin
fertilización nitrogenada, lo cual puede ser un factor fundamental en la
presencia y las características de los microorganismos endófitos presentes.
En
las tres variedades muestreadas se detectó G. diazotrophicus
tanto en el tallo como en la raíz, resultado coincidente con los obtenidos por
otros autores (Cavalcante y Döbereiner,
1988; Muthukumarasamy et al., 2000). Ello
reafirma la importancia de la propagación vegetativa de la caña de azúcar, que
es una de las formas de diseminación de G. diazotrophicus
(Muñoz-Rojas, 2005), con lo que se garantiza la transmisión de la bacteria
de una generación a otra en este cultivo.
Los
resultados de la caracterización fenotípica (anexo 1) mostraron que los
aislados estudiados presentan características similares a la cepa tipo PAl 5 (ATCC 49037) utilizada como patrón. Tales aislados
son catalasa positiva y oxidasa negativa, que tienen las capacidades de sobreoxidar la glucosa al 1 y al 30 %, tolerar acidez
extrema, crecer en sacarosa al 1 y al 30 %, oxidar el etanol a ácido acético,
no reducir el nitrato y fijar nitrógeno, todo lo cual coincide con la respuesta
de la cepa tipo y difiere de las características descritas para otras especies
fijadoras de nitrógeno del género Gluconacetobacter,
de acuerdo a lo expresado por Fuentes-Ramírez et al. (2002).
Es
importante destacar que, a pesar de los avances en el campo de la biología
molecular, los métodos fenotípicos son considerados la línea base de la
taxonomía polifásica. En este sentido, Vandamme et
al. (1996) señalaron que cualquier esquema taxonómico filogenético tiene
que presentar una consistencia fenotípica. La identidad fenotípica mostrada por
los aislados obtenidos, en comparación con la cepa tipo PAl
5 (ATCC 49037) y los resultados de estas pruebas de Cavalcante
y Döbereiner (1988) y de Gillis
et al. (1989), indica que los 46 aislados seleccionados pertenecen ala
especie G. diazotrophicus. Sería necesario de
corroborarlo posteriormente mediante pruebas moleculares.
Como proponen Saravanan et al. (2008), una interrogante importante
es cómo la colonización de la planta puede ser afectada por la expresión de
genes dependientes de la densidad celular en esta bacteria, por lo cual los
estudios de estos mecanismos pueden revelar la importancia de los procesos de
transducción de señales en el estilo de vida endofítico
de G. diazotrophicus.
Literatura
citada
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Anexo 1. Características
fisiológico-bioquímicas de los aislados en comparación con la cepa tipo de Gluconacetobacter diazotrophicus
PAl 5 (ATCC 49037).
Fisiological—biochemical
characteristics of isolates in comparison to Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5 type
(ATCC 49037).
+: reacción
positiva, -: negativa
1: Catalasa, 2: Oxidasa, 3: Pigmentos
carmelitas en YGC, 4: Oxidación del D-lactato, 5: Sobreoxidación
de glucosa al 1%, 6: Sobreoxidación de glucosa 30%,
7: Crecimiento en sacarosa al 30%, 8: Oxidación del etanol, 9: Fermentación de
la glucosa, 10: Fermentación de la lactosa, 11: Producción de H2S,
12: Producción de gas de glucosa, 13: Reducción de NO3-,
14: Fijación de nitrógeno, 15: Formación de ácido a partir de glucosa, 16:
sacarosa, 17: glicerol, 18: manitol, 19: xilosa, 20: inositol,
21. fructosa.