Aclimatación
de Nicotiana tabacum `Criollo´98´ (Solanaceae) a la salinidad creciendo en
condiciones de hidroponía
Acclimation of
Nicotiana tabacum `Criollo´98´ (Solanaceae) to salinity under hydroponic
conditions
Patricia Ortega-Rodés, Mayté Pernús, Rosa Rodés y Eduardo
Ortega
Facultad de Biología, Universidad de La Habana,
Cuba
Autor para correspondencia: portega@fq.uh.cu
RESUMEN
A
lo largo de su ciclo de vida, las plantas están expuestas a varios tipos de
factores estresantes externos, que impiden el mantenimiento de la homeostasis.
La salinidad es uno de los principales factores adversos que afectan el
crecimiento de las plantas y provoca grandes pérdidas en el rendimiento de
muchos cultivos. En el mundo hay grandes extensiones de suelos salinizados de
los que gran parte son suelos agrícolas. En Cuba el 20 % de los terrenos de
cultivo están en peligro debido a la salinidad; las provincias donde se cultiva
Nicotiana tabacum, no están exentas de este problema. Las plantas
presen-tan varios tipos de respuestas al estrés como la síntesis de metabolitos
y enzimas antioxidantes que contribuyen al proceso de aclimatación. Se
determinó el efecto del estrés salino sobre procesos de fotosíntesis, respiración,
formación de biomasa y la respuesta de sistemas de defensa en plantas de N.
tabacum ´Criollo´98´, excelente para la producción de Habanos. La actividad
foto-sintética fue afectada en las primeras horas de enfrentar las plantas a la
condición de salinidad impuesta en cultivo hidropónico (solución Hoagland suplementada
con 150 mmol L-1 NaCl); sin embargo, se observó una recuperación en un corto
período de tiempo (7 d). Se detectó mayor concentración de clorofila total y
carotenoides en plantas con el tratamiento salino, lo cual se interpreta como
una posible aclimatación de la fotosíntesis a la salinidad. La actividad
respiratoria fue semejante en plantas con tratamiento y plantas control. Otra
respuesta de aclimatación de las plantas fue evidenciado por un mayor valor de
la razón biomasa raíz: vástago en las plantas del tratamiento con sal, lo que
pudiera contribuir a una mayor absorción de agua por las raí-ces en estas
condiciones de estrés. Los estomas de las plantas sometidas a estrés salino
reaccionaron cerrándose parcialmente y alcanzaron valores del 30 % al 50 % de
las aperturas máximas registradas durante el ciclo diurno de las plantas
control; esta disminución en la apertura estomática no influyó en la fijación
de CO2 de las platas estresadas. Aunque se observó una aclimata-ción de la
fotosíntesis, la superficie foliar y la biomasa de las plantas en medio
salino
fue drásticamente disminuida; asociado a esto hubo daños en las membranas
celulares y cambios en la actividad de enzimas antioxidantes. La actividad
catalasa y guaiacol peroxidasa en las hojas fueron 4 y 3 veces mayores (con
relación a los controles) a partir de 1 h y 3 h de estar las plantas bajo
tratamiento salino, respectivamente. La actividad SOD disminuyó 3 veces con relación
al control en la primera hora de aplicar el estrés salino e incrementó hasta
valores semejantes al control entre las 3 y 52 horas posteriores.
Palabras
clave: Estrés salino, tabaco, fotosíntesis, densidad de estomas,
especies reactivas de oxígeno (EROs), Solanaceae
ABSTRACT
During their life cycle, plants are
exposed to various types of external stressors, preventing the maintenance of
homeostasis. Salinity is one of the main adverse factors affecting plant growth
and causes great losses in the yield of many crops. In the world there are
large areas of saline soils of which are largely agricultural soil. In Cuba 20%
of agricultural land are at risk due to salinity; the provinces where Nicotiana tabacum is growing, are
not exempt from this problem. The plants have various types of stress responses
as synthesis antioxidant metabolites and enzymes which contribute to the
process of acclimation The effect of salt stress on processes of
photosynthesis, respiration, biomass formation and defense response systems in
plants of N. tabacum `Criollo´98´, excellent for the production of
Habanos, was determined. The photosynthetic activity was affected in the early
hours of face plants to salinity conditions imposed in hydroponics conditions
(Hoagland solution supplemented with 150 mmol L-1 NaCl); however recovery was observed in a short period of time (7 d).
Higher concentration of total chlorophyll and carotenoids was detected in the
leaves of plants with the saline treatment, which is interpreted as a possible
photosynthetic acclimation to salinity. Respiratory activity was similar in
salt treated and control plants. Another answer acclimation of plants was
evidenced by a greater value of root: shoot biomass ratio in salt treated
plants, which could contribute to increased water uptake by the roots in these
stressful conditions. The stomata of the plants under salt stress reacted
partially closing, reaching values of 30 % to 50 % of the maximum apertures recorded
during the diurnal cycle of control plants; this decrease in stomatal opening did
not influence the CO2 fixa-tion of stressed plants. Although it was observed an
acclimation of photosynthesis in saline conditions, the leaf area and plant
biomass were drastically decreased; this was associated with damage to cell
membranes and changes in antioxidant enzyme activity. Catalase and guaiacol
peroxidase activity in the leaves were 4 and 3-fold higher (relative to
controls) after 1 and 3 h of being plants under saline treatment respectively.
SOD activity de-creased 3 fold relative to the control in the first hour of
applying salt stress and increased to values similar to con-trol between 3 and
52 hours later.
Keywords: Saline stress, tobacco,
photosynthesis, stomata density, reactive oxygen species (ROS), Solanaceae
Recibido: 2015-07-18
Aceptado: 2016-01-10
INTRODUCCIÓN
El
tabaco (Nicotiana tabacum L.) es un cultivo de importancia económica a
nivel mundial y en particular para Cuba, donde se produce un tabaco negro de
muy alta calidad para la producción de habanos (Espino y Torrecilla, 1999;
Borges et al., 2012).
A
lo largo de su ciclo de vida, todas las plantas están expuestas a factores
estresantes externos bióticos y abióticos (Roháček et al., 2008). El
estudio de la respuesta de las plantas al estrés abiótico es una de las líneas
de investigación más activas en la biología por las implicaciones de los
efectos del estrés en la agricultura. Entre los factores abióticos se encuentra
la salinidad de los suelos, uno de los problemas que más
afecta
la producción global de alimentos, aspecto de gran importancia debido al rápido
crecimiento de la población mundial.
De
las provincias cubanas donde se cultiva el tabaco las que poseen mayores áreas
afectadas por salinidad son Pinar del Río, Villa Clara, Sancti Spíritus, Granma
y Holguín con áreas afectadas de 54, 81, 100, 277, 180 mil hectáreas
respectivamente. Granma y Holguín parecen ser las provincias tabacaleras más
amenaza-das debido a los altos niveles de salinidad (>1,0 % de sales
solubles totales) reportados por González-Núñez et al. (2004).
La
comprensión de los cambios que tienen lugar en las plantas bajo estrés salino,
sería una herramienta importante en la solución de dichos problemas (Zhang et
al. 2011). Plantas de tabaco transgénicas han permitido entender el rol de
diferentes metabolitos en la respuesta a la salinidad, constituyendo además, un
modelo para el desarrollo de plantas tolerantes a este tipo de estrés
(Holmström et al. 2000; Penna 2003; Tuteja 2005). Sin embargo, la
información sobre el efecto de la salinidad sobre las respuestas fisiológicas
como alteraciones en la expansión foliar, tasa fotosin-tética, apertura
estomática y modificaciones de los sistemas antioxidantes son aún escasas para
el cultivo del tabaco. Este trabajo evalúa las respuestas fisiológicas a la
salinidad de plantas de Nicotiana tabacum `Criollo´98´ creciendo en
hidroponía.
MATERIALES Y MÉTODOS
Condiciones de crecimiento vegetal y estrés salino
Semillas
de Nicotiana tabacum `Criollo´98´ fueron germinadas en medio MS
(Sigma-Aldrich) suplementado con 20 g L-1
de sacarosa y 8 g L-1 de agar conteni-do en un tubo de 1,5 mL. Las semillas fueron
previa-mente esterilizadas superficialmente 5 min con solu-ción de
esterilización (4 µL Tritón X-100, 200 µL hipoclorito de sodio (12 %), 10 mL
ddH2O) y lavadas cuatro veces con ddH2O.
Dos
semanas más tardes, a los tubos que contenían las plántulas de tabaco se les
eliminó el fondo para permitir que las raíces emergieran. Los tubos fueron
colocados en bandejas que contenían 20 L de solución Hoagland (Hoagland y Arnon
1950) aireadas continua-mente para proveer las condiciones necesarias para la
respiración del sistema radical. El cultivo de hidroponía se realizó bajo
condiciones semi controladas (temperatura: 27±1,5oC,
iluminación: 100 µmol fotones m-2 s-1,
42,3 % HR, 12h luz/12h oscuridad).
Las
condiciones de estrés fueron aplicadas a las plantas de 30 d de edad. Un grupo
de plantas permaneció en las mismas condiciones de crecimiento (Control) en
solución Hoagland con una conductividad de 2,02 mS cm-1.
A un segundo grupo de plantas se les cambió la solución de crecimiento por
solución Hoagland suplementada con 150 mmol L-1
NaCl que llevó la conductividad de la solución a 14,80 mS cm-1.
El
material vegetal fue cosechado a diferentes tiempos e inmediatamente analizado
o congelado a -35oC
hasta
su posterior análisis. Las hojas de N. tabacum fueron enumeradas desde
el tope hacia la base del vástago.
Tasa de crecimiento e Intercambio de gases.
El
área de las hojas fue calculada utilizando las imágenes de las hojas
registradas en escáner CanoScanLi-de90 con una resolución de 300 dpi y a través
del pro-cesamiento y análisis de las imágenes con el Progra-ma ImageJ (Abramoff
et al. 2004).
La
masa seca y fresca de vástagos y raíces fue medida utilizando una balanza
digital (Mettler Toledo AB104, precisión 0,0001 g). Para las determinaciones de
la masa seca, las muestras fueron secadas a 90oC
en un horno hasta que el peso no varió. La longitud del vástago fue medido
desde la base hasta el punto más apical.
Para
medir la densidad y tamaño de los estomas, barniz de uñas incoloro transparente
fue aplicado a la superficie de la hoja con una brocha y removida usan-do cinta
adhesiva transparente como describen Weyers y Johansen (1985). Las impresiones
obtenidas fueron analizadas con un microscopio óptico Olympus BX-40 unido a una
cámara DP-70 usando el programa Stream Essentials 1.6.1 para el procesamiento
de las imágenes.
La tasa neta de fotosíntesis y respiración fue determinada
midiendo el incremento o disminución de la concentración de CO2
en el aire que pasó por la hoja encerrada en una cubeta con la ayuda de un
Analizador Infrarrojo de Gases (IRGA) Qubit Systems Inc, con sistema
abierto. Las medidas fueron realizadas una vez por semana durante 4 semanas,
con inicio 24 h después de la aplicación de las condiciones de estrés. Durante
las mediciones de fotosíntesis las muestras de hojas (9 cm2)
recibieron iluminación perpendicular de 185 µmol fotones m-2 s-1 y
un flujo de aire saturado de agua de 200 mL min-1.
Durante la medición se evitó el sobrecalentamiento de las hojas con un filtro
de agua de 1 cm de profundidad entre la fuente de luz y la hoja. Durante las
mediciones de la respiración, la luz fue totalmente excluida cubriendo la
cubeta con un tejido negro.
Pigmentos fotosintéticos, enzimas antioxidantes y daño
oxidativo
Las
clorofilas y los carotenoides se extrajeron de la muestra de hoja de 9 cm2 a
la que se midió la actividad fotosintética y respiratoria. Para ello se utilizó
una mezcla fría de acetona: NH4OH (9:1, v/v) por el
método descrito por Czarnecki et al. (2011); las concentraciones se determinaron espectrofotométricamente de acuerdo a Porra et
al. (1989). La actividad de enzimas antioxidantes catalasa (CAT),
superóxido dismutasa (SOD) y guaiacol peroxidasa (GPX) se determinó en el
tejido foliar.
Un
gramo de material vegetal fue macerado en mortero con la ayuda de nitrógeno
líquido, homogeneizado con 3 mL de tampón fosfato de potasio (100 mmol L-1,
pH 7) y centrifugado a 15000 xg, 4oC
durante 25 min. El sobrenadante fue utilizado para determinar la actividad CAT
(Kato y Shimizu 1987), SOD y GPX (Sharma et al. 2007).
Los
valores de densidad óptica fueron obtenidos en un espectrofotómetro Genesys 10S
UV-VIS. El contenido de proteínas solubles fue determinado según Bradford
(1976).
El
daño de membrana se cuantificó mediante dos métodos: la salida de iones y la
peroxidación lipídica. Para la determinación de la salida de iones se toma-ron
discos (2,5 cm de diámetro) de hojas y se siguió la metodología descrita por
Palta et al. (1977). La salida de iones de la hoja fue calculada como
Ci/Cf*100 (Gulen y Eris 2004) donde Ci y Cf son la conductividad eléctrica
inicial y final respectivamente. La oxidación de lípidos fue determinado en 200
mg de tejido fresco homogeneizado en una mezcla de etanol: dd H2O
(80:20, v/v) en una proporción 1:25 (Pf/v). Dos alícuotas de 1 mL cada una
fueron separadas después de centrifugar a 3000 xg. Una alícuota fue mezclada
con 1 mL de TCA (20 % w/v) y la otra fue mezclada con 1 mL of TCA (20 %)
suplementado con 0,65 % (w/v) ácido tiobarbitúrico (TBA). Ambas mezclas fueron
calenta-das a 95oC durante 25 min y la densidad óptica fue registrada a 440,
532 and 600 nm. El contenido de equivalentes de malondialdehido MDA fue referido como la cantidad de sustancias
que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBARS) y el cálculo se realizó de
acuerdo con Hodges et al. (1999) y los valores se ex-presaron en
equivalentes de MDA (nmol mL-1).
Análisis estadístico
El
programa STATISTICA versión 7, StatSoft Inc. (2004) fue utilizado para el
análisis de los datos. Los datos que cumplieron con las premisas de
distribución normal (chi cuadrado y homogeneidad de varianza) (prueba de
Levene) fueron analizados por prueba paramétrica, de no cumplirse la premisa,
se empleó
una
prueba no paramétrica. Un ANOVA simple se utilizó para analizar los diseños con
variables independientes de categoría simple. El ensayo de rangos múltiples
empleado fue la prueba de Tukey y para la comparación con un grupo control se
realizó la prueba de Dunnett. Kruskall Wallis fue utilizado en las pruebas
no-paramétricas.
Los
resultados de los análisis estadísticos se realiza-ron con un nivel de
significación de α=0,05.
RESULTADOS
Las
plantas de N. tabacum `Criollo´98´ crecidas bajo condiciones de
salinidad (150 mmol L-1 NaCl) mostraron una baja área foliar y una menor biomasa
total comparada con las plantas control (Fig. 1 A, B). Se observaron
diferencias significativas en el área foliar 15 d después de establecidas las
condiciones de estrés con valores que fueron la mitad del valor del con-trol.
Después de 27 d del tratamiento de estrés, la diferencia fue mayor con valores
7 veces menores en las plantas estresadas.
La
relación de biomasa vástago/raíz fue diferente a partir del segundo muestreo (8
d después del tratamiento) entre el control y las plantas estresadas, alcanzando
una relación menor en plantas bajo estrés salino, indicando una estimulación
del crecimiento de las raíces y una disminución del crecimiento del vástago
(Fig. 1 C).
Figura 1. Efecto de la salinidad en el
área foliar (A), biomasa total (B), y relación biomasa vástago/raíz (C) en
plantas de tabaco (Nicotiana tabacum `Criollo´98´). Letras diferentes denotan diferencias significativas
entre muestras (P< 0,05) por prueba de Tukey; n = 3.Las diferencias en la
biomasa entre el control y las plantas estresadas fueron solo significativas
después de 27 d de estrés; obteniéndose valores siete veces menores que el
control.
Figure 1. Effect of salinity on leaf area (A), total biomass (B), and
shoot/root biomass ratio (C) in tobacco (Nicotiana tabacum `Criollo´98´) plants. Different letters mean
significant difference among samples (P< 0.05) by Tukey test; n = 3.
La tasa fotosintética de la hoja es mucho menos
sensible a la disminución de la presión de turgencia que la expansión celular
(Boyer 1970). Sin embargo, un estrés de agua ligero usualmente afecta tanto la
fotosíntesis foliar y la conductancia estomática (Sung y Krieg 1979;
Ribas-Carbo et al. 2005). La tasa de foto-síntesis y respiración así
como la apertura estomática fueron analizadas para conocer en qué medida el
es-trés salino tiene efecto en el intercambio gaseoso.
Después
de 24 h de estrés salino, la actividad fotosintética de las plantas de tabaco
fue alrededor de la mitad (46 %) comparado con las plantas control (Fig. 2 A).
Sin embargo, una semana más tarde del comienzo del estrés salino, la actividad
fotosintética fue similar en ambos grupos de plantas. No hubo diferencia en la
actividad respiratoria en plantas tratadas en ninguno de los tiempos de
muestreo (Fig. 2 B).
Figura 2. Asimilación de CO2 (A) y actividad
respiratoria (B) en hojas de tabaco (Nicotiana tabacum `Criollo´98´) de
plantas bajo condiciones de estrés salino (150 mmol L-1 NaCl). Los datos
son mostrados como la media de 3 réplicas ±desviación estándar.* Indica
diferencias significativas entre las muestras (indicadas por los
corchetes) por una prueba t al nivel de
P < 0,05; ns: dife-rencias no significativas.
Figure 2. CO2 assimilation (A) and respiratory activity
(B) in tobacco (Nicotiana tabacum `Criollo´98´) leaves from plants under salt stress
conditions (150 mmol L-1 NaCl). Data are shown as means of the three replicates
±SD. *Indicates a significant diffe-rence of pairs by t-test indicated by
brackets at a level of P < 0.05; ns: no significant difference.
Las
plantas bajo condiciones de salinidad por 20 d no modificaron
significativamente la densidad de los estomas (Fig. 3 A); sin embargo, la
salinidad afectó la apertura de los estomas. Independientemente de la hora del
día, la apertura estomática fue menor en plantas bajo condiciones de salinidad
comparado con las plantas control (Fig. 3 B).
Las
plantas control tuvieron una mayor apertura estomática en horas tempranas de la
mañana. Las plantas bajo condiciones de salinidad tuvieron un área del poro
estomático dos veces más pequeño que las plantas control en la mañana y no
cambió el grado de apertura estomática durante el resto del día.
Figura 3. Efecto de la
salinidad en la densidad estomática de las hojas (A) y área del poro estomático
(B) de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum `Criollo´98´) a diferentes
horas del día después de 20 d de tratamiento salino (150 mmol L-1 NaCl). Barras,
desviación estándar; diferentes letras denotan diferencias significativas entre
las muestras (P < 0,05) por una prueba t en A y por prueba Tukey en B; n = 18; ns: diferencias no
significativas.
Figure 3. Salinity effect on the
density of guard cells per leaf are (A) and the area of the stomatal pore (B)
of tobacco (Nicotiana tabacum `Criollo´98´) plants at different times
after 20 d of saline treatment (150 mmol L-1 NaCl). Bars, standard deviation;
different letters denote significant difference between samples (P < 0.05)
by t-test in A and by Tukey test in B; n=18; ns: no significant difference.
Los
niveles de clorofila y carotenoides, calculados por área foliar, incrementaron
en plantas bajo condiciones de salinidad (Fig. 4 A, B). El incremento fue
significativo después de 15 d de tratamiento. Después de 22 d de mantenerse las
plantas bajo condiciones de salinidad, el contenido de clorofilas y
carotenoides fue alrededor de un 33 % y un 25 % mayor que en plantas control,
respectivamente.
Figura 4. Contenido
de clorofila (A) y carotenoides (B) en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum
`Criollo´98´) bajo condiciones de salinidad (150 mmol L-1 NaCl). Barras,
desviación estándar; diferentes letras denotan diferencias significativas entre
las muestras (P < 0,05) por prueba Tukey; n = 3.
Figure 4. Chlorophyll (A) and
carotenoids (B) content in tobacco (Nicotiana tabacum `Criollo´98´)
plants under saline conditions (150 mmol L-1 NaCl). Bars, standard deviation;
different letters mean a significant difference among samples (P < 0.05) by
Tukey test; n = 3.
Los
tejidos foliares de plantas de tabaco mostraron mayor porciento de salida de
electrolitos después de 52 h de tratamiento salino (21,4±1,3) con respecto a
las plantas del tratamiento control (12,0±1,9); sin embargo, el contenido de
MDA no cambió comparado con el control excepto después de 6 h de tratamiento
(Fig. 5). La presencia de MDA (Anbusrinivasan et al. 2009),
un producto secundario final de la oxidación de ácidos grasos poli-insaturados,
es considerado un indicador útil para la oxidación de lípidos en general.
La
actividad de la enzima Guaiacol peroxidasa (GPX) medida en las plantas tratadas
y las plantas control mostraron diferencias no significativas después de una
hora de estrés salino en las plantas de tabaco. Después de 3 h de tratamiento
hubo un incremento en la actividad GPX en los tejidos de las plantas
estresadas, alcanzando valores dos veces mayores que en las plantas
control.
Figura 5. Contenido de MDA en
tejidos foliares (hoja No 4) de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum
`Criollo´98´) bajo condiciones de salinidad (150 mmol L-1 de NaCl) y control.
Los datos son mostrados como la media de 3 réplicas ± des-viación estándar; *
Diferencias significativas.
Figure 5. MDA content in leaf (No 4)
tissue of tobacco (Nicotiana tabacum `Criollo´98´) plants under saline (150
mmol L-1 de NaCl) and control conditions. Data are means of three biological
replica ±SD; * Indicates a significant differen-ce from control by t-test at
the level of P < 0.05.
La
diferencia fue mantenida a las seis y 24 horas del tratamiento del estrés pero
después de 52 h la actividad GPX disminuyó en plantas en condiciones de salinidad,
alcanzando valores similares al control (Fig. 6 A).
La
actividad de la enzima catalasa en tejido foliar de las plantas tratadas fue
mayor que en las plantas con-trol después de una hora de tratamiento salino (Fig.
6 B) alcanzando valores tres veces mayores que el con-trol. La actividad de
esta enzima disminuyó con el tiempo hasta que alcanzó el valor obtenido en las
plantas control a las seis horas. Después de 52 h la actividad catalasa
incrementó nuevamente.
Después
de una hora de tratamiento salino, la actividad de la enzima superóxido
dismutasa (SOD) en tejidos foliares de las plantas tratadas fue tres veces
menor que en plantas control (Fig. 6 C). La actividad SOD, de plantas estresadas,
continuamente incrementó desde 3h después de comenzar el tratamiento y alcanzó
valores similares que las muestras controles.
Figura 6. Actividad de
enzimas antioxidantes en hojas de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum
`Criollo´98´) bajo condiciones de salinidad (150 mmol L-1 de NaCl) y control
medidas a varios tiempos después de aplicado el estrés. Actividad guaiacol
per-oxidasa A), catalasa B) y superoxido dismutasa C). Barras, desviación
estándar; diferentes letras denotan diferencias significati-vas entre las
muestras (P < 0,05) por prueba Tukey; n = 9.
Figure 6. Activity of antioxidant
enzymes in leaves of tobacco (Nicotiana tabacum `Criollo´98´) plants under
saline (150 mmol L-1 de NaCl) and control conditions measured at several time
point of the onset of stress. A)
Guaiacol peroxidase, B) catalase and C) superoxide dismutase activities. Bars, standard deviation; different
letters mean significant difference between samples (P < 0.05) by Tukey
test; n = 9.
DISCUSIÓN
La
homeostasis redox celular bajo condiciones de estrés requiere las respuestas
coordinadas de efectores del estrés que inducen modificaciones en la actividad
de proteínas y expresión génica por múltiples redes de señalización. Numerosos
cambios a diferentes niveles ocurrieron en las plantas de tabaco durante el
estrés abiótico aplicado en este trabajo; esto abarcó desde modificaciones
morfológicas, hasta bioquímicas y fisiológicas. Estos cambios incluyen una
repuesta temprana al estrés mediante cierre estomático, modi-ficaciones de la
fotosíntesis, cambios en el contenido
de
pigmentos y respuestas de protección antioxidante para eliminar eficientemente
las posibles EROs producidas.
Aplicando
sal a las plantas de tabaco creciendo en condiciones de hidroponía, el
potencial de agua de la solución Hoagland fue de 0,66 MPa menor que el control
(solución Hoagland sin sal). La reducción del área foliar y la producción de
biomasa de plantas de taba-co sujetas a condiciones de salinidad (Fig. 1) fue
una consecuencia de la poca disponibilidad de agua debi-do a un incremento del
contenido de sal en la solu-ción nutritiva, y la reducción de su potencial
osmóti-co. En condiciones de salinidad, además del estrés hídrico, las plantas
sufren toxicidad debido al exceso intracelular de Na+ y Cl- (Buchanan et al.
2015).
El
bajo potencial de agua alcanzado durante el estrés hídrico y salino provoca que
la célula se contraiga y la presión de turgencia hacia la pared celular
disminuya. Las actividades dependientes de turgencia, tales como la expansión
celular y la elongación de las raíces son más sensibles al déficit de agua. La
inhibición de la expansión celular resulta en un retraso de la expan-sión de la
hoja en condiciones de déficit de agua (Taiz y Zeiger 2006). Además, como el
contenido de agua disminuye, el proceso de emergencia de la hoja en el
meristemo es afectado (Tichá et al. 1995). Así, la defi-ciencia de agua
disminuye la formación de tejido foto-sintético. Bajo estrés salino/hídrico,
señales químicas incluído el ácido abscísico (ABA) y las citoquininas
originadas en la raíz, son transportadas a través del xilema hacia la hoja lo
que unido a cambios en el pH, provocan el cierre estomático (Schachtman y
Goodger 2008). Las respuestas de cierre estomático durante etapas de poca
disponibilidad de agua en el suelo resultan en menos producción de biomasa. Los
pre-sentes resultados muestran un menor incremento del área foliar y la biomasa
en similar proporción durante el tratamiento salino (Fig. 1). La reducción del
área foliar es una respuesta de aclimatación a condiciones de estrés que
contribuye a evitar una posible desecación, pero representa un compromiso para
la toma de luz y CO2, provocando una menor síntesis y distribu-ción de
foto-asimilados y acumulación de biomasa en las plantas.
El
proceso de asimilación de dióxido de carbono fue afectado en las plantas de
tabaco después de 24 h de que fue aplicado el tratamiento salino, sin embargo,
los valores de fotosíntesis neta fueron similares a las plantas no estresadas
después de 7 y 22 d de aplicado el estrés (Fig. 2). Esto es una evidencia de
aclimatación
a
condiciones desfavorables. A pesar del recobrado de la actividad fotosintética
después de 7 d de estrés, los valores bajos de fotosíntesis obtenidos después
de 24 h de estrés tuvieron consecuencias en el área foliar fotosintéticamente
activa y en la producción de bio-masa por planta (Fig. 1). El efecto en la
asimilación de CO2 pudo estar relacionado en primera instancia con un cierre
estomático. La alcalinización en la savia xilemática inducida por el estrés
hídrico, puede funcionar como una señal de la raíz que promueve el cierre estomático
temprano, trayendo una disminución de la pérdida de agua por transpiración y un
incremento de la eficiencia del uso del agua (Schachtman y Goodger 2008). El
mantenimiento de la densidad estomática después de 20 d de estrés salino (Fig.
3) se debe a que el conteo de los estomas por área se realizó en hojas que ya
estaban formadas en el momento de aplicado el estrés. La disminución de la
fijación fotosintética de CO2 observada durante las primeras horas de estrés
(Fig. 2) pudiera estar relacionado con el cierre estomático, pero después de 7
y 20 d bajo condiciones de estrés salino las plantas lograron mantener similar
actividad de fijación fotosintética comparada con el control, a pesar de que
las células oclusivas estaban más cerradas que el control aunque mantuvieron
una pequeña área del poro abierta (Fig. 3). Una mayor eficiencia fotosintética
pudiera ser la razón de este resultado. La tolerancia del fotosistema II (PS
II) a la salinidad y a la baja iluminación es una estrategia de las plantas
para sobrevivir a estas condiciones de es-trés según proponen Jamil et al.
(2007).
En
contraste con la fotosíntesis, la tasa respiratoria no cambió durante los
experimentos de salinidad (Fig. 2). Previamente, otros autores observaron que
durante el estrés hídrico, los cambios en la actividad respiratoria fueron más
pequeños que en la fotosíntesis (Collén et al. 2013). La respiración comienza
a comprometerse bajo condiciones de estrés cuando la fo-tosíntesis es
fuertemente afectada (Ribas-Carbo et al. 2005). Bajo condiciones de
estrés hídrico en soya (Glycine max L.), un incremento de la actividad
de la oxidasa alternativa (AOX) y una disminución de la acti-vidad citocromo
oxidasa COX) tienden a balancear la respiración total (Ribas-Carbo et al.
2005); sin embar-go, la reducción de la respiración total, en Nicotiana sylvestris Speg. &
Comes, durante el estrés hídrico es predominantemente debido a una reducción en
la actividad COX, mientras que la actividad AOX permanece casi inalterada
(Galle et al. 2010). En el presente experimento, una proporción de cada
vía respiratoria
(COX
y AOX) pudiera ser afectada por el estrés, pero esto no fue investigado. Bajo
diferentes condiciones de estrés, las plantas necesitan dedicar una gran
can-tidad de energía para preservar las funciones vitales (respiración de
mantenimiento) y menos energía para el crecimiento y procesos biosintéticos
(respiración de crecimiento) (Thornley 1970; 1977). Una tasa de res-piración
inalterada y la aclimatación en la tasa fotosintética durante el estrés salino
contribuyó al mante-nimiento de las funciones vitales en las plantas de tabaco.
El incremento en el contenido de clorofila por área foliar, pudiera haber
contribuido a la aclimatación en la fotosíntesis observada después de 22 días
de estrés salino. Sin embargo, no solo las clorofilas, sino también los
pigmentos accesorios como los caro-tenoides, incrementaron después de 15 y 22 d
des-pués del tratamiento salino (Fig. 4). El contenido de clorofila de las
hojas bajo estrés salino tiene una respuesta de inhibición/estimulación que
varía de acuerdo al cultivar, tiempo de exposición y concentración de sales.
Hay un patrón diferente en la acumulación de pigmentos en cultivares sensibles
y resistentes; los cultivares con menores afectaciones en el contenido de
pigmentos tienen mayor protección bajo estrés salino (Misra et al. 1997;
Doganlar et al. 2010). Un incremento en el contenido de clorofila en
condi-ciones de salinidad se ha vinculado con un aumento en el número de
cloroplastos (Aldesuquy 1992). Un incremento en el volumen de cloroplastos en
hojas de espinaca (Spinacia oleracea L.) fue obtenido en condiciones de
200 mmol L-1 NaCl (Robinson et al. 1983). En N. tabacum no
se ha encontrado ningún informe previo de cambios del contenido de clorofilas
en condiciones de estrés salino. Un aumento en el contenido de clorofila
después de un estrés a largo plazo tam-bién pudiera estar asociado con la
inhibición de su degradación. El catabolismo inicial de la clorofila ocu-rre a
un nivel de recambio basal durante la senescencia de la hoja y la maduración de
los frutos (Eckhardt et al. 2004). Este proceso está también asociado
con una mayor actividad del mecanismo de defensa frente a la degradación
peroxidativa de la clorofila, conocida como “bleaching”, en hojas jóvenes (Kato
y Shimizu 1987) y menor degradación de la clorofila. Menos degradación, unida a
no afectación de su síntesis puede explicar el incremento de clorofila total
encontrada en el experimento conducido.
En
plántulas de la familia Cucurbitaceae (Cucurbita pepo L. y Cucurbita
moschata Duch.) en condiciones de estrés salino, la degradación de la
clorofila es evi-tada por una alta protección antioxidante (Sevengor et al.
2011). Plantas de N. tabacum con el gen que codifica para la enzima
alcohol deshidrogenasa (ADH) silenciado fueron susceptibles y mostraron mayor
degradación de la clorofila total en condiciones de estrés hídrico; sugiriendo
el papel de la ADH en la protección de la maquinaria fotosintética en condiciones
de estrés(Senthil-Kumar et al. 2010). Sin embargo, el papel de la ADH
confiriendo tolerancia al estrés es desconocido. En conocimiento de los
autores, no exis-te otro informe en el cual la baja degradación del con-tenido
de clorofila esté relacionada con una alta pro-tección antioxidante durante el
estrés abiótico en plantas de tabaco. Una red compleja de reacciones
enzimáticas y moléculas antioxidantes controlan las concentraciones de especies
reactivas de oxígeno (EROs) y reparan el daño oxidativo (Willekens et al.
1997; Noctor y Foyer 1998; Young y Lowe 2001; Grene 2002; Reddy y Raghavendra
2006).
La
salinidad es uno de los factores que puede promover la formación de EROs y
provocar en las plantas estrés oxidativo (Wang et al. 2004). El estrés
oxidativo puede causar afectaciones en la integridad y permeabilidad selectiva
de las membranas celulares. Un pará-metro usado frecuentemente para evaluar el
impacto del estrés sobre la estabilidad de las membranas es el eflujo de
electrolitos (Campos et al. 2003; Kocheva et al. 2009; Zhang y Wu
2009; Dong et al. 2013). Los resultados actuales indican que el
tratamiento salino provocó una marcada afectación sobre la funcionali-dad de
las membranas celulares, ya que el eflujo de electrolitos (expresado en %) fue
el doble en las plan-tas de tabaco bajo estrés comparadas con el control.
El
incremento en las concentraciones de MDA, uno de los productos finales de la
peroxidación lipídica, también constituye un indicador del estrés oxidativo
junto al peróxido de hidrógeno (H2O2)
(Kocheva et al. 2009; Abogadallah 2011). En las plantas de tabaco sometidas
a 150 mmol L-1 de NaCl no se encontró, en general, variaciones significativas
en el contenido de equivalentes de MDA con respecto al control en las mediciones
realizadas (Fig. 5) excepto a las 6 h de trata-miento; lo que difiere por
completo con el porciento de eflujo de electrolitos en dichas plantas.
Ante
diferentes condiciones desfavorables como estrés hídrico y bajas temperaturas,
se ha observado en plantas de trigo (Triticum aestivum L.) y pepino (Cucumis
sativus L.) respectivamente, un incremento tanto en el eflujo de
electrolitos como en la concen-tración de MDA (Kocheva et al. 2009; Dong
et al. 2013). Sin embargo, Campos et al. (2003) no encontra-ron
una correspondencia entre eflujo de electrolitos y producción de MDA en algunas
variedades de café (Coffea sp.) luego de ser sometidas a estrés por
bajas temperaturas. Estos autores sugieren que en las plan-tas donde los
cambios en el contenido de MDA no fue-ron significativos, existen eficientes
mecanismos anti-oxidantes que pueden evitar la peroxidación lipídica. Cambios
transitorios en la actividad de las enzimas GPX, CAT y SOD observados en hojas
de tabaco (Fig. 6) como una consecuencia del estrés salino durante los primeros
dos muestreos, sugiere un mecanismos rápido en respuesta a la producción de
EROs.
Los
incrementos en las actividades de las enzimas CAT y GPX en condiciones de
estrés salino (Fig. 6) están en concordancia con su posible función en
cooperación para eliminar el contenido de H2O2.
Como la catalasa tiene una velocidad máxima superior a las peroxida-sas,
remueve la mayoría del peróxido mientras que las peroxidasas reducen el resto
(Willekens et al. 1997). Esto es indiscutiblemente dependiente del
compartimento celular en el cual el H2O2
es generado. El H2O2 no está estrictamente compartimentado y es capaz de difundir
libremente a través de las membranas (Willekens et al. 1997). La
disminución de la actividad total SOD en la primera hora del experimento
pudiera parecer contradictorio con la consideración de que esta enzima es la
primera línea de defensa frente a EROs como reportó Alscher et al.
(2002), removiendo superóxido (O2- ) del sitio de
generación. El O2- es reducido a H2O2
el cual a su vez es reducido a H2O por las enzimas catalasa
y peroxida-sas (Thannickal y Fanburg 2000). Una baja actividad SOD bajo
condiciones de salinidad pudiera evitar la formación de niveles tóxicos de H2O2
en esta situación. Las plantas han desarrollado un sistema de defensa en contra
de EROs, que involucra tanto una producción limitada de EROs como su
eliminación (Alscher et al. 2002).
El
incremento en la actividad de GPX y CAT en plantas de tabaco bajo condiciones
de estrés salino (Fig. 6) indica que las concentraciones de H2O2
en la célula incrementaron en estas condiciones desfavorables. Pero la baja
actividad SOD indica que el H2O2
no fue originado de la dismutación de O2-
en estas condiciones experimentales. El H2O2
es también generado durante el transporte de electrones en la mitocondria, en
el proceso de fotorrespiración en los peroxisomas y en la β–oxidación de los
ácidos grasos en los glioxisomas. Los niveles celulares de este metabolito
es-tán determinados por la tasa de producción y la activi-dad de las enzimas
antioxidantes que lo eliminan (Neill et al. 2002).
El
incremento de la fotorrespiración en condiciones de estrés salino pudiera
prevenir la formación de EROs en los cloroplastos (Chaves et al. 2009;
Maurino y Peterhansel 2010; Miller et al. 2010) y así, proteger el PS II
de daños (Hershbach et al. 2010). Así la fotorrespiración es un componente
importante del proceso involucrado en la disminución de la producción de EROs
(disipando el exceso de equivalentes de reducción así como de energía), aunque
el mismo sea una fuente de producción de H2O2,
involucrado también en la transducción de señales durante el estrés (Voss et
al. 2013). El incremento del contenido de H2O2
en plantas de tabaco durante el estrés salino, inferido a partir de la alta
actividad GPX y CAT (Fig. 6), puede estar relacionado con un incremento de la
fotorrespiración. Los resultados de este trabajo evidencian la aclimata-ción de
las plantas de tabaco del cultivar ´Criollo´98´, a las condiciones de salinidad
del orden de 150 mmol L-1 NaCl, lo que fue facilitado por el control de la apertura
estomática sin afectación de la actividad fotosintética; la regulación de la
razón de biomasa vástago: raíz que le
permite a la planta utilizar mejor los niveles de humedad del suelo y el
control de la aparición de especies reactivas de oxígeno en los tejidos.
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