Importancia funcional de la Pro80 para la interacción con membranas y la formación de poros por la sticholysina I, actinoporina de Stichodactyla helianthus (Anthozoa: Stichodactylidae)

Resumen

Resumen: La sticholisina I (StI) es una actinoporina producida por la anémona de mar Stichodactyla helianthus. Aunque no se conoce con exactitud el mecanismo molecular de formación de poros de las actinoporinas se plantea que transcurre por varias etapas: la unión inicial a la membrana, la oligomerización, el despliegue del segmento del extremo amino y la formación final del poro transmembrana. La estructura tridimensional de las actinoporinas se caracteriza por un núcleo central de hojas-b intercaladas flanqueado por dos hélices-a, un sitio de unión interfacial mediante el cual interactúan con los lípidos de las membranas, y lazos que interconectan las fibras b. La región estructural de las actinoporinas menos estudiada es la de los lazos localizados hacia el sitio de interacción con la membrana. El lazo b4-b5, que comprende los residuos 76 al 84 de StI, es uno de los de mayor flexibilidad conformacional de la proteína. Con el objetivo de evaluar la contribución de esta región al mecanismo de formación de poros se diseñó y obtuvo el mutante StI P80C. El residuo de Pro⁸⁰ es el más expuesto dentro del lazo b4-b5 y se encuentra conservado en la familia de las actinoporinas. La proteína mutante StI P80C se expresó en el sistema de Escherichia coli y se purificó en un solo paso mediante cromatografía de intercambio catiónico. La introducción de un residuo de cisteína en la posición 80, no alteró los rasgos conformacionales de la toxina según los estudios de espectroscopía de fluorescencia y dicroísmo circular. Esta sustitución aminoacídica no afectó la capacidad de unión de StI a membranas modelo, sin embargo, modificó su actividad permeabilizante frente a eritrocitos humanos y liposomas. Los resultados sugieren que la Pro⁸⁰ de StI pudiera participar en un evento o etapa posterior a la unión inicial a las membranas y previa a la formación del poro funcional.

Palabras clave: citolisinas, fluorescencia, dicroísmo circular, proteína formadora de poros, permeabilización de membranas, mutantes de Cys

ABSTRACT: Sticholysin I (StI) is an actiporin produced by the sea anemone Stichodactyla helianthus. The mechanism of pore formation by actinoporins is a multistep process, involving binding of the water-soluble monomer to the membrane and subsequent oligomerization on membrane surface, leading to the functional pore formation. However, the molecular details of the mechanism of membrane insertion and oligomerization have not been completely clarified yet. The tridimensional structure of actinoporins display a common fold characterized by a b-sandwich core flanked by two a-helices, a membrane recognition site and loops interconnecting all b-sheets. The less studied structural regions of actinoporins include the loops located at the protein-membrane interaction face. The loop that connects b4 and b5 strands, comprising residues 76–84 of StI, displays the highest conformational flexibility of the whole protein in solution. In order to get insights into the contribution of this region to the actinoporins pore forming mechanism, we devised and obtained the mutant StI P80C. Pro⁸⁰ is the most solvent-exposed residue in the b4-b5 loop and is well conserved along the actinoporin protein family. StI P80C was expressed in a bacterial system and purified in a single step by cation exchange chromatography. The conformational characterization derived from fluorescence and CD spectroscopic studies of StI P80C revealed that replacement of Pro⁸⁰ by Cys in StI did not noticeably change the conformation of the protein in solution. Interestingly, this amino acid substitution did not affected StI binding to membrane, whereas provoked noticeable changes in its permeabilizing activity both in erythrocytes and liposomes. These results suggest that StI Pro⁸⁰ could be involved in step after that of membrane initial binding and prior to the functional pore formation.

Keywords: cytolysins, fluorescence, circular dichroism, pore-forming protein, membrane permeability, Cys mutants