ARTÍCULO ORIGINAL

 

Aislamiento e identificación de Gluconacetobacter diazotrophicus a partir de variedades de caña de azúcar cultivadas en Cuba

Isolation and identification of Gluconacetobacter diazotrophicus from sugarcane varieties growing in Cuba

 

Marcia Rojas, Julia Manzano y Mayra Heydrich

Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana

 

* Autor para correspondencia: marcia@fbio.uh.cu

 

Resumen

La caña de azúcar constituye uno de los principales cultivos agrícolas para nuestro país y tiene gran importancia, desde los puntos de vista económico y ecológico, a nivel mundial. La presencia de Gluconacetobacter diazotrophicus en diferentes cultivos de interés económico en el mundo sugiere que esta especie establece una interacción beneficiosa. La potencialidad de los microorganismos endófitos para su uso en la agricultura es muy promisoria, por lo cual la detección de la especie Gluconacetobacter diazotrophicus resulta fundamental para su futura utilización. En este trabajo se estudiaron 18 variedades de caña de azúcar cultivadas en Cuba mediante el aislamiento de la bacteria endófita G. diazotrophicus. Se detectó la presencia de esta especie en 13de las variedades sobre la base de las características micromorfológicas y culturales de los aislados obtenidos. Por primera vez se demostró la presencia del endófito en las variedades Cuba 1616-75, Cuba 751-75, Campos Brasil 44-52 y SP701143 cultivadas en Cuba. Se seleccionaron 46 aislados provenientes de las variedades Jaronú 60-5, Cuba 323-68 y Media Luna 318 y se identificaron mediante pruebas fisiológicas y bioquímicas como pertenecientes a la especie en estudio.

Palabras clave: Gluconacetobacter diazotrophicus, caña de azúcar, aislamientos, identificación

 

ABSTRACT

Sugarcane is one of the most important commercial crops in Cuba and other countries in the world. The worldwide occurrence of G. diazotrophicus in sugarcane and other plants suggest a beneficial association between this species and grass species. The potentialities of endophytes in the agricultural biotechnology are very high, that is why the detection of this bacterium inside of sugarcane is so important. The aim of this work was to detect the occurrence of Gluconacetobacter diazotrophicusin 18 varieties of sugarcane growing in Cuba. This species was isolated in 13 varieties on the basis of micromorphological and colonies characteristics. For the first time it was isolated G. diazotrophicus from varieties Cuba 1616-75, Cuba 751-75, Campos Brasil 44-52 and SP701143 cultivated in Cuba. The 46 isolates from the varieties Jaronú 60-5, Cuba 323-68 and Media Luna 318 were identified as G. diazotrophicus by morphological and biochemical test.

Keywords: Gluconacetobacter diazotrophicus, sugarcane, isolation, identification

 

Recibido: 2008-09-23

Aceptado: 2008-12-20

 

Introducción

Existen varias alternativas para el desarrollo de sistemas agrícolas que usan los microorganismos. Entre las principales acciones beneficiosas de las bacterias se incluyen la producción de hormonas promotoras del crecimiento (Sturz et al., 1998), la solubilización de minerales, la fijación de nitrógeno (Gaskins et al., 1984) y el control de patógenos (Mari et al., 1996). Por su gran importancia, se ha previsto la utilización de los microorganismos endófitos en diferentes agroecosistemas.

A finales de los años ochenta se aisló de la caña de azúcar la especie acetobacter diazotrophicus, actualmente Gluconacetobacter diazotrophicus (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Gillis et al., 1989). Esta bacteria tiene la capacidad de fijar nitrógeno en presencia de NO3- (10 mM), (Cavalcante y Döbereiner, 1988) y produce sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal (Fuentes-Ramírezet al., 1993). Además, G. diazotrophicus pudiera utilizarse como control biológico de patógenos ya que se han realizado experimentos in vitro demuestran que su potencialidad para inhibir el crecimiento de los hongos Colletotrichum falcatum Went. (Muthukumarasamy et al., 2000) y la bacteria Xanthomonas albilineans (Piñón et al., 2004). En Cuba, esta especie bacteriana se aisló a partir de las variedades de caña de azúcar Jaronú 60-5 (Coego et al., 1992) y Media Luna 318 (Dong et al., 1994). Posteriormente se detectó su presencia en algunas variedades procedentes de Banco de Semilla (Pérez et al., 2001) y de otras de uso comercial (Ortega et al., 1996; 2002).

El presente trabajo tiene como objetivo pesquisar la presencia de la especie Gluconacetobacter diazotrophicus en variedades de caña de azúcar cultivadas en Cuba e identificar los aislados con vistas a su utilización en el mejoramiento de cultivos agrícolas de interés.

 

Materiales y métodos

En este estudio fueron realizados aislamientos a partir de 18 variedades de caña de azúcar (Saccharum sp.) utilizando dos métodos diferentes (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Dong et al., 1994). En ambos casos, fueron sembrados en medio LGIP semisólido sin nitrógeno (Cavalcante y Döbereiner, 1988). Los frascos fueron incubados durante un periodo de siete a diez días a 30ºC.

A los aislados seleccionados les fueron realizadas pruebas morfológicas y fisiológico-bioquímicas haciendo uso de la cepa tipo de G. diazotrophicus PAl 5 (ATCC 49037) como patrón. Les fueron aplicadas las pruebas descritas en el Manual de Bergey (De Ley et al., 1984) y las específicas para esta especie señaladas por Cavalcante y Döbereiner (1988). Para las observaciones de las células se empleó el microscopio electrónico de transmisión mediante tinción negativa con acetato de uranilo.

 

Resultados y discusión

Los cultivos microbianos con características similares a G. diazotrophicus en los frascos de medio LGI-P semisólido sin nitrógeno (144) mostraron, a los siete días de incubación, un crecimiento en forma de película amarillo-naranja en la superficie y un cambio en la coloración del medio. Cuando se sembraron en placas Petri con este mismo medio de cultivo, 117 aislados formaron colonias pequeñas, amarillo-naranja, de bordes regulares, y en medio Papa-agar tomaron una coloración carmelita. Estos aislados, además, respondieron negativamente a la tinción de Gram, mostraron forma bacilar y no formaron endosporas ni cápsulas, lo cual coincide con las características descritas para la especie G. diazotrophicus (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Gillis et al., 1989). Los resultados de las observaciones con el microscopio electrónico corroboraron la similitud existente entre la morfología celular de todos los aislados y la cepa tipo PAl 5, así como la presencia de flagelación lateral o peritrica.

Estos resultados demuestran que G. diazotrophicus se encuentra presente en 13 de las 18 variedades de caña de azúcar estudiadas, de las cuales se obtuvieron 117 aislados de la especie en este estudio. No se encontró en las variedades Cuba 1751, Cuba 294-70, Jaronú 64-19, Cuba 8751 ni Cuba 120-78. En tal sentido, Pérez et al. (2001) señalaron la falta de interacción entre estas dos últimas variedades y G. diazotrophicus, lo cual podría estar relacionado con la capacidad de la caña de azúcar para seleccionar los endófitos mediante la unión de los microorganismos con determinadas glicoproteínas solubles presentes en el jugo (Legaz et al., 2000). Se demuestra por primera vez la presencia de G. diazotrophicus en las variedades Cuba 1616-75, Cuba 751-75, Campos Brasil 44-52 ySP701143 cultivadas en Cuba (figura 1).

 

 

 

Figura 1. Distribución de 117 aislados con características típicas de Gluconacetobacter diazotrophicus encontrados en 13 variedades de caña de azúcar cultivadas en Cuba.

Figure 1. Distribution of 117 isolates with tipical characteristics of Gluconacetobacter diazotrophicus found in 13 varieties of sugarcane growing in Cuba.

 

Tales resultados coinciden con los obtenidos por Ortega et al. (1996), que demostraron la presencia de G. diazotrophicus en las variedades Canal Point 5243, Cuba 323-68 y Cuba 266-70.No ocurrió así con las variedades Cuba 120-78 y Cuba 8751, lo cual pudo deberse a que las plantas muestreadas no estaban cultivadas en la misma localidad y, por tanto, estaban sometidas a condiciones ecológicas diferentes. Pérez et al. (2001) obtuvieron resultados similares al trabajar con estas mismas variedades, en las cuales el aislamiento de G. diazotrophicus estaba influenciado por las condiciones edafoclimáticas.

Muñoz-Rojas y Caballero-Mellado (2003) probaron que la relación entre G. diazotrophicus y la caña de azúcar depende del genotipo de ambos organismos. Aunque coincidimos con el criterio delos mencionados autores, consideramos que otros factores pueden influir sobre la interacción entre la variedad de la planta y el genotipo de la bacteria, como pueden ser las características del suelo, las condiciones climáticas, la edad del cultivo y la fertilización nitrogenada. Se ha demostrado que la presencia de G. diazotrophicus en las plantas puede estar determinada por el grado de fertilización nitrogenada a que estén sometidas las plantaciones (Fuentes-Ramírez et al., 1993; Loganatan et al., 1999), aspecto este último que también inhibe la colonización de la planta por la bacteria (Fuentes-Ramírez et al., 1999).

Para continuar con nuestro estudio se seleccionaron 46 aislados de tres variedades de caña de azúcar teniendo en cuenta para los tres casos la alta frecuencia de aparición de la bacteria estudiada. Además, las variedades Jaronú 60-5 y Cuba 323-68 han sido las más utilizadas en la producción azucarera en el país durante los últimos cuarenta años (González et al., 2004) y la variedad Media Luna 318 había sido cultivada durante más de diez años sin fertilización nitrogenada, lo cual puede ser un factor fundamental en la presencia y las características de los microorganismos endófitos presentes.

En las tres variedades muestreadas se detectó G. diazotrophicus tanto en el tallo como en la raíz, resultado coincidente con los obtenidos por otros autores (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Muthukumarasamy et al., 2000). Ello reafirma la importancia de la propagación vegetativa de la caña de azúcar, que es una de las formas de diseminación de G. diazotrophicus (Muñoz-Rojas, 2005), con lo que se garantiza la transmisión de la bacteria de una generación a otra en este cultivo.

Los resultados de la caracterización fenotípica (anexo 1) mostraron que los aislados estudiados presentan características similares a la cepa tipo PAl 5 (ATCC 49037) utilizada como patrón. Tales aislados son catalasa positiva y oxidasa negativa, que tienen las capacidades de sobreoxidar la glucosa al 1 y al 30 %, tolerar acidez extrema, crecer en sacarosa al 1 y al 30 %, oxidar el etanol a ácido acético, no reducir el nitrato y fijar nitrógeno, todo lo cual coincide con la respuesta de la cepa tipo y difiere de las características descritas para otras especies fijadoras de nitrógeno del género Gluconacetobacter, de acuerdo a lo expresado por Fuentes-Ramírez et al. (2002).

Es importante destacar que, a pesar de los avances en el campo de la biología molecular, los métodos fenotípicos son considerados la línea base de la taxonomía polifásica. En este sentido, Vandamme et al. (1996) señalaron que cualquier esquema taxonómico filogenético tiene que presentar una consistencia fenotípica. La identidad fenotípica mostrada por los aislados obtenidos, en comparación con la cepa tipo PAl 5 (ATCC 49037) y los resultados de estas pruebas de Cavalcante y Döbereiner (1988) y de Gillis et al. (1989), indica que los 46 aislados seleccionados pertenecen ala especie G. diazotrophicus. Sería necesario de corroborarlo posteriormente mediante pruebas moleculares.

Como proponen Saravanan et al. (2008), una interrogante importante es cómo la colonización de la planta puede ser afectada por la expresión de genes dependientes de la densidad celular en esta bacteria, por lo cual los estudios de estos mecanismos pueden revelar la importancia de los procesos de transducción de señales en el estilo de vida endofítico de G. diazotrophicus.

 

Literatura citada

Cavalcante, V. A. y J. Döbereiner (1988): A new acid tolerant nitrogen-fixing bacterium associated with sugar cane. Plant and Soil, 108: 23-31.

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Anexo 1. Características fisiológico-bioquímicas de los aislados en comparación con la cepa tipo de Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5 (ATCC 49037).

Fisiological—biochemical characteristics of isolates in comparison to Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5 type (ATCC 49037).

+: reacción positiva, -: negativa

1: Catalasa, 2: Oxidasa, 3: Pigmentos carmelitas en YGC, 4: Oxidación del D-lactato, 5: Sobreoxidación de glucosa al 1%, 6: Sobreoxidación de glucosa 30%, 7: Crecimiento en sacarosa al 30%, 8: Oxidación del etanol, 9: Fermentación de la glucosa, 10: Fermentación de la lactosa, 11: Producción de H₂S, 12: Producción de gas de glucosa, 13: Reducción de NO₃^-, 14: Fijación de nitrógeno, 15: Formación de ácido a partir de glucosa, 16: sacarosa, 17: glicerol, 18: manitol, 19: xilosa, 20: inositol, 21. fructosa.