ARTÍCULO DE REVISIÓN

 

Aplicación de enzimas en biocatálisis. Perspectivas de la utilización de nanoarreglos como biocatalizadores

Application of enzymes on biocatalysis. Perspectives of the use of nanoarrays as biocatalysts

 

Alberto del Monte-Martínez,¹* Bessy V. Cutiño-Avila,¹ Jorge O. González-Bacerio,¹ Darío González-Abradelo,² Viviana Figueroa Espí³ y Roberto Cao-Vázquez²

¹Laboratorio de Tecnología Enzimática, Centro de Estudio de Proteínas, Facultad de Biología, Universidad de la Habana, Cuba.

²Laboratorio de Bioinorgánica, Facultad de Química, Universidad de la Habana, Cuba.

³Laboratorio de nanobiotecnología y liberación de Biomoléculas, Instituto de Ciencia y Tecnología de Materiales (IMRE), Universidad de la Habana, Cuba.

 

*Autores para correspondencia: adelmonte@fbio.uh.cu

 

RECIBIDO: 1/2013

ACEPTADO: 6/2013

 

INTRODUCCIÓN

Muchas reacciones químicas pueden ocurrir espontáneamente y a una velocidad apreciable sin necesidad de catalizadores, mientras que otras deben ser catalizadas para que se produzcan a una velocidad elevada. Los catalizadores son moléculas que reducen la magnitud de la barrera energética que debe ser superada para que una sustancia pueda convertirse químicamente en otra (energía de activación). Termodinámicamente, la magnitud de esta barrera de energía se puede expresar convenientemente en términos de energía libre. En realidad, los catalizadores hacen transcurrir la reacción por un mecanismo distinto al de la reacción no catalizada, de manera que el nuevo complejo de transición, en presencia del catalizador, muestra una energía de activación menor que el complejo de transición de la reacción original. El catalizador no se consume o altera durante la reacción; en principio, puede utilizarse para convertir el sustrato en producto de manera indefinida. En la práctica, este comportamiento está limitado por la estabilidad del catalizador, es decir, su capacidad de retener su estructura activa a través del tiempo en las condiciones de reacción.

Las enzimas son catalizadores biológicos que han sido estudiados extensivamente por más de cien años y desempeñan un papel fundamental en la mayoría de los procesos bioquímicos. Estas moléculas han sido seleccionadas evolutivamente para realizar sus funciones en condiciones fisiológicas; sin embargo, es posible aprovechar sus propiedades como catalizadores de manera artificial. La aplicación de las enzimas en procesos industriales abarca una serie de aspectos y áreas, tales como la Química Verde, la Biotecnología Blanca y la Química Sustentable, así como la discusión sobre los recursos renovables y los recursos fósiles. Estas áreas pueden solaparse en mayor o menor medida y tienen en común que pueden contribuir a un desarrollo sustentable de la sociedad (Grunwald, 2009). La mayoría de los especialistas en este campo coinciden en definir la biocatálisis como la utilización de enzimas en la catálisis de diferentes procesos –industriales o no– en condiciones artificiales (in vitro).

El desafío mayor en biocatálisis es transformar estos catalizadores biológicos en catalizadores capaces de trabajar en condiciones de reacción normalmente alejadas de las fisiológicas, como las de un proceso industrial. Las enzimas, como catalizadores de reacciones bioquímicas (biocatalizadores), actúan del mismo modo que cualquier catalizador–disminuyen la energía de activación–; pero, al mismo tiempo, muestran propiedades diferentes a las encontradas en los catalizadores químicos: 100 % de rendimiento, incrementos mucho mayores en la velocidad de reacción, versatilidad química, gran especificidad, posibilidad de regulación, labilidad estructural. Todas estas propiedades son consecuencias de su compleja estructura molecular (Illanes, 2008).

En este trabajo se presenta una revisión actualizada del tema de la biocatálisis: las clases de enzimas más utilizadas, los principales productos obtenidos, las ventajas y desventajas de los biocatalizadores en comparación con los catalizadores químicos, los mayores retos de la utilización industrial de esta tecnología, así como las herramientas disponibles en la actualidad para superarlos.

 

Ventas globales de enzimas

Las ventas globales de enzimas de uso industrial se estimaron, para el año 2002, en1820, 3 millones de dólares a un ritmo de crecimiento anual del 4 %. Las predicciones del empleo de enzimas a nivel industrial son muy alentadoras (BCC report C144NA, 2002). Si se produce el incremento esperado habrá una gran penetración en el mercado de las aplicaciones ya existentes, nuevas aplicaciones y tecnologías novedosas basadas en la mejora de las características funcionales de las enzimas, lo cual las haría más atractivas para su empleo a nivel industrial (Biotechnology Center of Excellence Corporation, 2003).

Las aplicaciones en las industrias de alimentación humana y animal dominan las ventas industriales de enzimas a nivel mundial (figura 1). El mercado de alimentación animal ofrece el mejor escenario para el crecimiento; pero este mercado aún no ha sido penetrado extensamente por las ventas de enzimas en todas las áreas geográficas por igual. En el sector de los detergentes, los catalizadores biológicos han ocupado el mercado casi por completo, especialmente en los detergentes para lavado. En este campo, los detergentes «lavavajillas» aún representan un tentativo escenario de crecimiento en cuestión de ventas. Debido a que la ingeniería genética ha permitido disponer de las proteasas alcalinas en cantidades mayores que las de cualquier otra enzima recombinante, el precio de estas moléculas ha disminuido. No obstante, la ingeniería genética también ha contribuido a mejorar las propiedades catalíticas de muchas enzimas, con el objetivo de elevar la eficiencia en su funcionamiento. En relación con la comercialización de otros limpiadores (como desinfectantes y blanqueadores), las ventas de enzimas representan un porcentaje escaso. Por tanto, este constituye un mercado casi virgen que ofrece nuevas oportunidades para la venta, si estas cuentan con las propiedades adecuadas (BCC Report C-144NA, 2002; Biotechnology Center of Excellence Corporation, 2003).

 

 

 

 

Figura 1. Ventas globales de enzimas (en millones de dólares) estimadas para 2002, clasificadas según el tipo de industria destinataria.

Fuente: Adaptado de BCC Report C-147NA , 2002; BiotechnologyCenter of Excellence Corporation, 2003.

 

En el sector textil, las ventas de enzimas para la degradación de materiales celulósicos dominan el mercado. La influencia de la moda, que encarece las ropas de apariencia «prelavada», posiblemente haga florecer el mercado para las enzimas procesadoras de mezclillas. Por otra parte, se espera que la introducción de nuevas fibras celulósicas en el mercado eleve las ventas de las enzimas necesarias para procesarlas. Las ventas de enzimas para el cuero y las pieles se afectan por la tendencia negativa de la moda hacia estos materiales. Aun así, la comercialización de proteasas y lipasas (alcalinas) ha ido en aumento, pero debe competir con las ventas de enzimas tradicionales como la tripsina (BCC Report C-144NA, 2002; Biotechnology Center of Excellence Corporation, 2003). En el tratamiento de la pulpa y el papel, las enzimas más empleadas son las xilanasas, específicamente en el preblanqueamiento. En este campo, las oxidasas han tenido un buen desempeño y han sido muy estudiadas, pero no en términos de incrementar su eficiencia; por ello se necesita un mayor esfuerzo de investigación en esta área antes de incrementar su comercialización.

La empresa manufacturera de productos químicos, que incluye la químico-farmacéutica, es el sector final a nivel de mercado para el empleo de enzimas industriales. El empleo de enzimas para elevar la producción de alcohol –no para la producción de bebidas– domina este mercado. El resto de las enzimas se emplea en reacciones de química fina, para la producción de fármacos y sus intermediarios. La mayoría de los avances de la tecnología enzimática actualmente ha tenido lugar en el contexto de reacciones en química fina. Estos avances, en su mayoría, corresponden al aspecto de la tecnología quiral, la cual aprovecha la estereoselectividad de algunas enzimas para la síntesis de un enantiómero específico. Si se analiza desde un punto de vista comercial, las enzimas que se utilizan en reacciones de química fina se usan en pequeñas cantidades, por lo que los volúmenes que se producen son pequeños y los valores de las ventas son bajos. En estos casos, el valor real de las enzimas no es el que aparentan, ya que los productos de las reacciones de química fina tienen un costo elevado, por lo que la inversión es muy rentable desde ese punto de vista (BCC Report C-144NA, 2002; Biotechnology Center of Excellence Corporation, 2003).

Si se analizan las ventas de enzimas, desglosadas según las distintas clases, se comprueba que las hidrolasas dominan las ventas de enzimas industriales de manera global (figura 2a). Las otras clases (isomerasas, oxidorreductasas, liasas y transferasas) se comercializan en menor cantidad. La clase isomerasa está representada prácticamente por una sola enzima –la glucosa isomerasa– y las ligasas están casi ausentes a ni vel industrial. Dentro de las hidrolasas, las carbohidrasas dominan en las aplicaciones industriales y constituyen un elevado porcentaje de las ventas (figura 2b). En segundo lugar en importancia comercial se encuentran las proteasas; y luego, en menor medida, las lipasas, esterasas, fosfatasas y amilasas (BCC report C-144NA, 2002; Biotechnology Center of Excellence Corporation, 2003).

 

Figura 2. Ventas globales de enzimas (en porciento) para procesos químicos industriales, estimadas para 2002: a) clasificación de las ventas de enzimas según las distintas clases; b) clasificación de las ventas de las hidrolasas según las distintas subclases.

Fuente: Adaptado de BCC Report C-147NA , 2002; Biotechnology Center of Excellence Corporation, 2003.

 

Potencialidades e inconvenientes de la utilización de enzimas como catalizadores en procesos industriales

De las casi tres mil enzimas que han sido descritas, muchas están disponibles comercialmente –varias en forma inmovilizada (Mosier y Ladisch, 2011), lo que posibilita su reutilización en los procesos en que se apliquen. Las enzimas son catalizadores muy deseables cuando la especificidad de la reacción se convierte en un problema de primer orden, como ocurre con los productos farmacéuticos y de química fina (figuras 3 y 4). Además, son capaces de catalizar muy eficazmente un espectro grande de reacciones, las cuales pueden ser de 10 a 12 órdenes de magnitud más rápidas que con el empleo de catalizadores convencionales. Las enzimas son generalmente muy selectivas con respecto al tipo de reacción catalizada y al sustrato transformado; y pueden ser, incluso, específicas para elementos estereoestructurales del sustrato.

Figura 3. Reacciones de hidrólisis de ésteres de interés en las industrias química y químico-farmacéutica, utilizando un biocatalizador inmovilizado obtenido a partir de esterasas interfaciales aisladas de la anémona marina Stichodactyla helianthus (286 u/g soporte): a) ácido 7-amino cefalosporánico «7-aca»; b) 2-oxiranilmetil acetato (acetato de glicidol) «omac»; c) feniletilbutirato«Bpet»; d) etil-2-hidroxi-4-fenilbutanoato«HpBet»; e) metil-6-metoxi-α-metil-2-naftalen-acetato (éster metílico del naproxeno) «me-mmnac»; f) metil-prostaglandina F₂α «me-pga2».

Fuente: Del Monte-Martínez, 2000.

 

Figura 4. Resolución de mezclas racémicas de compuestos de interés en las industrias química y químico-farmacéutica, utilizando un biocatalizador inmovilizado obtenido a partir de esterasas interfaciales aisladas de la anémona marina Stichodactyla helianthus (286 u/g soporte). condiciones de reacción: a) Na₂HPO₄ 0,025 mol/l, pH 7, 25 °C; b) Na₂HPO₄ 0,025 mol/l, pH 7, 25 °C; c) Na₂HPO₄ 0,025 mol/l, pH 7, 4 °C; d) Na₂HPO₄ 0,01 mol/l, pH 7, 4 °C; e) Na₂HPO₄ 0,2 mol/l, pH 7; f) Na₂HPO₄ 0,025 mol/l: acetonitrilo (9:1, v:v), pH 7, 30 °C; g) Na₂HPO₄ 0,025 mol/l: metanol (9:1, v:v), pH 7, 30 °C.

 

Como macromoléculas quirales, las enzimas son capaces de catalizar transformaciones asimétricas que pueden ser enantioméricas y enantiotopo-selectivas (figura 4). La actividad y la selectividad de las enzimas en explotación pueden modificarse por varios factores tales como la concentración de sustrato y producto, la temperatura, el pH, y a través de otras moléculas presentes en el sistema. Estos efectos pueden aprovecharse para dirigir los procesos hacia la obtención del producto deseado (Del Monte-Martínez, 2000).

Las enzimas constituyen una alternativa muy atractiva cuando los catalizadores deben ser activos bajo condiciones suaves (temperatura ambiente y pH casi neutro) debido a la inestabilidad del sustrato y/o del producto, o para evitar reacciones colaterales no deseadas, como ocurre en muchas reacciones de síntesis orgánica (figura 5). Esto es de primera importancia con productos que tienden a isomerizarse. Algunas enzimas tienen la capacidad de introducir grupos funcionales en posiciones que no son reactivas con los reactivos orgánicos más comunes. Esta alternativa es controlable desde el punto de vista experimental. Por ejemplo, las reacciones de hidroxilación selectiva de compuestos aromáticos, catalizadas por la peroxidasa de rábano picante, Armoracia rusticana (figura 5), deben realizarse a muy bajas temperaturas (0 ºC) para prevenir hidroxilaciones no enzimáticas provocadas por el ácido dihidroxifumárico y el oxígeno, ambos utilizados como cofactores. Las peroxidasas se han utilizado también en la obtención de difenoles, a partir de la oxidación de fenoles en posición orto, y en la oxidación de aminoácidos y alcoholes que contienen un resto p-hidroxifenilo. A partir de precursores monohidroxilados o no hidroxilados, se han obtenido compuestos como L-DOPA –utilizado para el tratamiento del Parkinson–, D-3,4-dihidroxifenilglicina y L-epinefrina (adrenalina), entre otros (Klibanov et al., 1981; Schwartz y Hutchinson, 1981; Ballard et al., 1983; Sinisterra, 1994).

 

Figura 5. Hidroxilaciones selectivas de compuestos aromáticos utilizando como biocatalizador la enzima peroxidasa aislada del rábano picante (armoracia rusticana): a) d-3,4-dihidroxifenilglicina; b) l-dopa; c) l-epinefrina; d) difenol. Fuente: Klibanov et al., 1981; schwartz y Hutchinson, 1981; Ballard et al., 1983; sinisterra, 1994.

 

Las enzimas como biocatalizadores resultan muy oportunas cuando las restricciones medioambientales y las regulaciones para la producción de medicamentos, establecidas por los gobiernos, son severas. Esta es una situación generalizada en la actualidad, que otorga una ventaja distintiva a la biocatálisis sobre las tecnologías tradicionales. Sin embargo, los catalizadores enzimáticos son estructuras moleculares complejas, intrínsecamente lábiles y con un alto costo de obtención, lo cual constituye su principal desventaja respecto a los catalizadores químicos tradicionales (Bommarius y Broering, 2005). Por otro lado, la baja productividad volumétrica es a menudo un problema. Sin embargo, esto no debe asumirse como una gran desventaja, ya que en la actualidad algunos bioprocesos operan a concentraciones que igualan

o normalmente exceden aquellas encontradas en los procesos químicos (industriales) convencionales. Un ejemplo notable es un proceso que ha sido desarrollado por Novo-Nordisk para surfactantes basados en azúcares, con el uso de una lipasa como catalizador: un ácido graso de cadena larga es esterificado con un azúcar en ausencia de solvente y se logra casi el 100 % de formación del producto (Macrae y Hammond, 1985). Otros aspectos que pudieran considerarse como desventajas de los biocatalizadores son:

                        a.             Necesidad de cofactores.

                        b.             Incompatibilidad con solventes orgánicos, particularmente los polares.

                        c.             Carencia, a menudo, de propiedades buscadas por el ingeniero de procesos: fuerza mecánica y propiedades reológicas, ya que la aplicación de células enteras o la enzima inmovilizada conducen a sistemas heterogéneos.

                        d.             Posibilidad de inhibición.

                        e.             Problemas operacionales de separación de fases (Arroyo, 1998).

 

Estrategias actuales para la solución de los inconvenientes de la aplicación de enzimas como catalizadores en procesos industriales

La mayoría de las restricciones que presentan las enzimas como catalizadores en procesos industriales se han solucionado a través de la investigación y el desarrollo en diferentes áreas del conocimiento. De hecho, se han desarrollado varias estrategias de estabilización de enzimas para que funcionen adecuadamente en las condiciones de los procesos industriales en los que se desea aplicarlas (Illanes, 1999). Estas estrategias incluyen técnicas como:

                        a.             Modificación química de la estructura de la enzima (Roig y Kennedy, 1992; Ozturk et al., 2002; Mislovičová et al., 2006).

                        b.             Inmovilización de la enzima a soportes sólidos (Abián et al., 2001; Mateo et al., 2005; Kim et al., 2006a).

                        c.             Cristalización de la enzima y entrecruzamiento de los cristales con agentes bifuncionales (Haring y Schreier, 1999; Roy y Abraham, 2006).

                        d.            Obtención de agregados y posterior entrecruzamiento con agentes bifuncionales (Cao et al., 2003; Mateo et al., 2004; Schoevaart et al., 2004; Illanes et al., 2006).

                        e.            Aplicación de técnicas modernas de diseño de proteínas para el aumento de la estabilidad y mejoramiento de las propiedades catalíticas (Chen, 2001; Declerck et al., 2003; Sylvestre et al., 2006; Leisola y Turunen, 2004).

                        f.             Mutagénesis de sitio específico para el aumento de la estabilidad y mejoramiento de las propiedades catalíticas (Bhosale et al., 1996; Ogino et al., 2001; Boller et al., 2002; Van den Burg y Eijsink, 2002; Adamczak y Hari Krishna, 2004; Bardy et al., 2005; Mor-ley y Kazlauskas, 2005).

                        g.             Evolución dirigida por mutagénesis en «tándem», o barajado de ADN asistido por polimerasa y recombinación genética asistida por ligasas para el aumento de la estabilidad y mejoramiento de las propiedades catalíticas (Stemmer, 1994; Shibuya et al., 2000; Arnold, 2001; Brakmann y Johnsson, 2002; Alexeeva et al., 2003; Chodorge et al., 2005; Kaur y Sharma, 2006; Boersma et al., 2004).

 

El tamizaje de enzimas intrínsecamente estables constituye una estrategia de mucha actualidad en biocatálisis. Los extremófilos, organismos capaces de vivir y crecer en condiciones medioambientales extremas, son una fuente prometedora para la obtención de enzimas muy estables (Adams y Kelly, 1998; Demirjian et al., 2001; Davis, 2003; Van den Burg, 2003; Bommarius y Riebel, 2004; Gomes y Steiner, 2004), por lo que la investigación centrada en el aislamiento de enzimas de estos organismos es en la actualidad un área de mucha actividad dentro de la comunidad científica. Se han clonado genes de organismos extremófilos en hospederos convenientes para su expresión en sistemas biológicos, con mejores rendimientos en la producción (Halldórsdóttir et al., 1998; Haki y Rakshit, 2003).

 

Clases de enzimas y su empleo en biocatálisis

Las enzimas se clasifican de acuerdo con la guía publicada por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB, 1984). Todas las enzimas informadas están comprendidas en seis clases, sobre la base del tipo de reacción química que catalizan. Según la Comisión de Enzimas (EC) de la IUBMB, cada enzima se identifica con cuatro dígitos. El primero asigna la clase; el segundo y el tercero asignan la subclase y la sub-subclase, respectivamente, de acuerdo con el tipo y la posición del enlace o grupo particular involucrado en la reacción; el cuarto dígito asigna el número de identificación de la enzima sobre la base de la reacción específica que ella cataliza. Las seis

clases son:

1-       Oxidorreductasas: presentan 23 subclases. Catalizan reacciones de oxidación-reducción sobre diferentes grupos funcionales, por ejemplo:

HC-OH

C=O

HC-CH

HC-NH₂

C-NH

 

2-       Transferasas: presentan 9 subclases. Catalizan la transferencia de grupos funcionales, por ejemplo:

Grupos mono-carbonados

Grupos aldehído o cetona

Grupos acilo

Grupos glicosilo

Grupos alquilos o arilos

Grupos nitrogenados

Grupos con fósforo

Grupos con azufre

3-       Hidrolasas: presentan 13 subclases. Catalizan reacciones de hidrólisis, por ejemplo:

Enlaces ésteres

Enlaces glicosídicos

Enlaces peptídicos

Otros enlaces C-N

Enlaces anhídrido de ácidos

4-       Liasas: presentan 4 subclases. Catalizan reacciones de ruptura de enlaces covalentes por mecanismos distintos de la hidrólisis o la oxidación, por ejemplo:

Enlaces C-C

Enlaces C-O

Enlaces C-N

5-       Isomerasas: presentan 6 subclases. Catalizan reacciones de isomerización, por ejemplo:

Racemizaciones y epimerizaciones

6-       Ligasas : presentan 6 subclases. Catalizan reacciones de formación de enlaces covalentes, por ejemplo:

C-O

C-S

C-N

C-C

 

A continuación se presentan algunos ejemplos clásicos de enzimas utilizadas en biocatálisis, agrupadas según las clases mencionadas: oxidorreductasas (peroxidasas, catalasas, glucosa oxidasas y lacasas); transferasas (fructosil y glucosil transferasas) e hidrolasas (amilasas, celulasas, lipasas, pectinasas, proteasas, pululanasas). Estas son las enzimas con mayor número de aplicaciones. En condiciones apropiadas pueden catalizar la reacción inversa y formar enlaces con eliminación de agua. Este tipo de reacción se considera que posee un promisorio potencial tecnológico. Por su parte, las liasas (pectato liasa, α-acetolactato descarboxilasa, nitrilo hidroliasa, aspartato amonio liasa, fumarato hidratasa, L-histidina amonio liasa) usualmente actúan en la formación de enlaces C-C mediante la reacción inversa a la que deben su nombre. Esto les confiere un atractivo potencial para aplicaciones tecnológicas. También están involucradas en otros procesos biocatalíticos como la producción de L-aspartato, fumarato y ácido urocánico. Estas enzimas se han utilizado con mucha frecuencia en la síntesis asimétrica de compuestos orgánicos ópticamente activos. Las isomerasas (glucosa isomerasa, actualmente D-xilosa aldosacetosa-isomerasa, mutasas) constituyen uno de los ejemplos paradigmáticos de la aplicación de enzimas en procesos tecnológicos. Se emplean en la producción de siropes ricos en fructosa (HFS) a partir de almidón de maíz. Por último, dentro de las ligasas el caso con aplicación más conocido es la 4 ADN ligasa, utilizada rutinariamente en técnicas de ingeniería genética. Generalmente, las enzimas de esta clase son consideradas complejas e inestables, por lo que se encuentran prácticamente ausentes en aplicaciones a escala industrial (Illanes, 2008).

Aunque es lógico que haya una relación directa entre el porcentaje de ventas y el empleo de enzimas, existen variaciones en dependencia del tipo de proceso biocatalítico donde se utilizan. En la figura 6 se muestra un esquema con los tipos de enzimas más utilizados en síntesis orgánica.

 

Figura 6. Tipos de enzimas más utilizadas en biocatálisis con énfasis en síntesis orgánica (porciento de utilización).

 

Producción industrial de compuestos a través del empleo de enzimas como biocatalizadores

La utilización de enzimas como biocatalizadores para la producción de compuestos a nivel industrial es muy alentadora (BCC Report C-144NA, 2002). La información presentada en la tabla 1 ilustra la importancia creciente de dicha utilización en procesos industriales. Para este estudio comparativo se seleccionaron desde los productos a granel más baratos hasta los más caros, como los que se obtienen mediante reacciones de química fina (vitaminas o antibióticos). Algunos de estos compuestos no pueden obtenerse por síntesis química tradicional. Por otra parte, las aplicaciones industriales de las enzimas en función del tipo de reacción que catalizan se muestran en la tabla 2.

Entre las compañías más importantes en la producción y venta de enzimas se encuentran: Novozymes (Dinamarca), DSM (Holanda), Genencor International (Finlandia, EE. UU.), Fluka (Suiza), Amano Pharmaceutical Co. (Japón), Sankyo Co. (Japón) y Sigma Chemical (EE. UU.). Los procesos en los que intervienen estas proteínas deben ser congruentes con las características y propiedades de la enzima a emplear. Por ejemplo, debe tenerse en cuenta la tolerancia a elevadas temperaturas, la estabilidad frente al pH y a solventes orgánicos, entre otros factores.

 

Tabla 1. Producción mundial (en toneladas, año 2002) y precio (USD/kg) de varios compuestos que son el resultado de diferentes procesos enzimáticos.

 

Nanopartículas: presente y perspectivas para su aplicación en biocatálisis

A lo largo de este artículo dedicado a la biocatálisis, se ha informado acerca de la utilización de las enzimas en varios campos relacionados con la producción industrial de compuestos, así como otros procesos y áreas de actividad en los que estas intervienen como biocatalizadores. Es necesario aclarar que no existe necesariamente una vinculación directa entre estas aplicaciones y la escala o los procesos establecidos a nivel de industria (síntesis orgánica). Otro aspecto ya mencionado es la insolubilización o inmovilización de enzimas como procedimiento muy generalizado para enfrentar el reto de la estabilización de estas proteínas (Guisán et al., 1993). En gran medida, la inmovilización se consigue mediante la unión de la enzima a superficies sólidas, porosas o no, lo que permite la reutilización del biocatalizador y elimina otra de las restricciones para la aplicación de este tipo de moléculas en procesos químicos.

 

Tabla 2. Aplicaciones de enzimas a gran escala en bioquímica industrial, organizadas de acuerdo con el tipo de reacción que catalizan. (Se muestran los productos que sintetizan y la producción en toneladas en el año 2000.)

Fuente: Soetaert y Vandamme, 2006; Illanes, 2008; Grunwald, 2009.

 

En la inmovilización de proteínas sobre superficies sólidas, uno de los componentes esenciales es el material al cual se unirá la enzima. Las dimensiones de este pueden abarcar desde la micro hasta la nano-escala (Liu et al., 2012), ya que las nanopartículas pueden actuar también como soportes para la inmovilización, de forma similar a las matrices utilizadas convencionalmente. Se conocen los avances en química biomimética y su relación con las enzimas artificiales y la catálisis por diseño (Breslow, 1995). Debido al alto costo y los problemas de estabilidad presentados por las enzimas naturales, se han realizado grandes esfuerzos para sustituirlas por enzimas artificiales o miméticas (Breslow, 1995; Zen y Kumar, 2001; Wulff, 2002). En este sentido, se han logrado resultados exitosos en la obtención de materiales miméticos de citocromo P450 (Volz y Holzbecher, 1994; Aissaoui et al., 1998; Schenning et al., 1998), proteasas de tipo serino (Ghosh et al., 1999), dioxigenasas (Funabiki et al., 1998; Chen y Que, 1999), fosfodiesterasas (Molenveld et al., 1999), ligasas (Han et al., 2000), nucleasas (Muche y Gobel, 1996), así como en el proceso de metanogénesis (Signor et al., 2000). En el campo de los materiales miméticos, se han informado muchos resultados vinculados a la actividad peroxidasa, incluidos compuestos como hemina (Aissaoui et al., 1998; Zhu et al., 1998; Fruk y Niemeyer, 2005), hematina (Genfa y Dasgupta, 1992), hemoglobina (Wang et al.,2002),ciclodextrina(Liu et al., 1999), porfirinas (Ci et al., 1993; Bonar-Law y Sanders, 1995), empleados todos para la detección de H₂O₂ y ácido ascórbico (Genfa y Dasgupta, 1992; Wang et al., 2000; Wang et al., 2002).

Debido al interés biotecnológico generado por las nanopartículas, dado por su importancia, los nanomateriales –especialmente los nanomateriales funcionales– han atraído la atención de los investigadores en los últimos años (Roucoux et al., 2002; Burda et al., 2005; Gao et al., 2004; Pérez, 2004; Wei y Wang, 2008). En virtud de su elevada relación superficie/volumen, los nano-materiales son muy atractivos para ser utilizados como catalizadores eficientes en catálisis homogénea o heterogénea, aplicaciones para las que han sido estudiados intensamente en la última década (Roucoux et al., 2002; Burda et al., 2005).

Los nanomateriales magnéticos, como la magnetita (Fe₃O₄), se han empleado asiduamente en estudios de resonancia magnética, liberación de drogas, separaciones biológicas, e incluso en catálisis biológica. Estos nanomateriales magnéticos son química y biológicamente inertes per se, por lo que generalmente se funcionalizan con metales catalíticos, enzimas o anticuerpos con el objetivo de elevar su funcionalidad (Bergemann et al., 1999; Yang et al., 2004; Brähler et al., 2006).

Los sistemas miméticos de peroxidasas presentan iones Fe²⁺ o Fe³⁺ en sus centros de reacción. Es bien conocido el reactivo de Fenton, que consiste en una disolución de iones Fe²⁺/Fe³⁺ que cataliza la degradación del peróxido de hidrógeno y es ampliamente utilizado para el tratamiento de aguas residuales (Figueroa-Espí, 2010). En el caso de las nanopartículas de magnetita, no existen informes que expliquen el mecanismo catalítico de la actividad peroxidasa; sin embargo, se ha propuesto que los átomos de hierro de la superficie contribuyen a la actividad observada y que los iones Fe²⁺ desempeñan un papel importante en la catálisis (Gao et al., 2004).

Este acercamiento a la relación existente entre las nanopartículas y la biocatálisis comienza, según nuestra apreciación, a partir de dos puntos de vista:

1.            Considerar como biocatalizadores las nanopartículas con actividad catalítica intrínseca, como la presentada por varios materiales miméticos (figura 7).

2.            Considerar como biocatalizadores las na nopartículas con enzimas inmovilizadas (figura 8). Es decir, estos biocatalizadores son nanomateriales sobre los que se inmovilizan proteínas –pudieran considerarse nanoarreglos– mediante un tratamiento de funcionalización –pudiera no ser necesario– similar al aplicado a los soportes utilizados tradicionalmente.

La aplicación de nanopartículas miméticas y nano-arreglos (nanopartículas magnéticas, de oro, de plata, nanotubos de carbono, entre otras) en catálisis y en procesos de reconocimiento se encuentra muy documentada en la literatura especializada (Kim et al., 2006a; Figueroa-Espí, 2010). Por ejemplo, se han utilizado nanopartículas magnéticas funcionalizadas para inmovilizar distintos ligandos, tales como un anticuerpo policlonal anti-Escherichia coli (Cheng et al., 2009), una lipasa (Huang et al., 2003), colesterol oxidasa (Kouassi et al., 2005) y fosfatasa alcalina (Saiyed et al., 2004). En todos los casos se obtuvieron altos porcentajes de inmovilización y alta tolerancia a variaciones de pH, temperatura y concentración de sustrato.

 

Figura 7. Nanopartículas magnéticas compuestas por ferrita de manganeso (MnFe₂O₄). Imagen obtenida mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). se visualiza la forma esférica de las nanopartículas con un diámetro en el intervalo entre 5 y 15 nm. este tamaño es indicador de excelentes capacidades catalíticas, ya que existe una relación inversa entre el tamaño de la nanopartícula y su actividad catalítica.

 

Las tecnologías de celdas de biocombustibles basadas en enzimas inmovilizadas (citocromo c, lacasas, glucosa oxidasas, peroxidasas, alcohol deshidrogenasa, aldehído deshidrogenasa, formaldehído deshidrogenasa, glucosa deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa), que utilizan como combustible la glucosa, reciben en la actualidad una atención particular y se hacen cada día más competitivas en aplicaciones prácticas (Kim et al., 2006b; Wan, 2011). Las dos limitaciones principales encontradas hasta el momento están relacionadas con el corto tiempo de vida media y la baja densidad, propiciados por los problemas de estabilidad de las enzimas, la velocidad de transferencia de electrones y la carga enzimática permitida en los biocatalizadores.

 

Figura 8. Inmovilización de enzimas sobre nanopartículas de oro funcionalizadas: a) grupo funcional: ácido mercaptoundecanoico, enzima: tripsina de páncreas bovino (Bos taurus); b) grupo funcional: cisteamina, enzima: lacasa (trametes maxima).

 

Los recientes progresos en nanobiocatálisis abren posibilidades de mejoramiento en estos aspectos. Muchos materiales nanoestructurados, como los soportes mesoporosos, las nanopartículas, las nanofibras y los nanotubos, han demostrado su eficiencia en la inmovilización de enzimas. Estos materiales presentan una alta conductividad, facilidades cinéticas para la reacción y un área superficial elevada, lo que posibilita el aumento de la carga de enzima en el biocatalizador; ello a su vez permite resolver el problema relacionado con la densidad en la construcción de celdas de biocombustibles. Además, los esfuerzos realizados para incrementar la retención de la actividad funcional y la estabilidad de las enzimas inmovilizadas, con el uso de nanoestructuras, han permitido un apreciable progreso en la biocatálisis nanoestructurada, ya que han posibilitado superar el mayor obstáculo en el desarrollo de mejores celdas de biocombustibles (Kim et al.,2006b).Este es un ejemplo claro de cómo pueden combinarse las nanociencias y la ingeniería para solucionar las dificultades relacionadas con las propiedades dependientes del tamaño y los fenómenos que se presentan a escala nanométrica. Esta alianza ha permitido a los científicos desarrollar nuevos procedimientos para lograr tecnologías de procesos químicos eficientes y sustentables (Wan, 2011). Si retomamos la definición de biocatálisis más aceptada por los especialistas en esta área (utilización de enzimas como catalizadores de procesos en condiciones artificiales), entonces es discutible la inclusión de las nanopartículas catalíticamente competentes y miméticas dentro de los biocatalizadores. Sin embargo, consideramos acertado incluir los nanoarreglos, basados en la inmovilización de enzimas sobre la superficie de nanopartículas, en el campo de la biocatálisis. Estos biocatalizadores presentan un potencial aún no explotado al máximo en procesos biocatalíticos.

 

CONCLUSIONES

Las enzimas constituyen catalizadores biológicos con propiedades muy atractivas para múltiples aplicaciones, como la biocatálisis, la cual consiste en el aprovechamiento de la función catalítica de estas proteínas para producir una transformación química deseada en condiciones artificiales. La amplia demanda de representantes de todas las clases de estas moléculas para procesos industriales se refleja en las ventas anuales, superiores a los mil millones de dólares en todo el mundo. Asimismo, el extraordinario beneficio social que se deriva del uso de las enzimas queda evidenciado por la producción anual de decenas de millones de toneladas de compuestos químicos obtenidos a partir de la utilización de biocatalizadores. El principal reto en biocatálisis consiste en manipular las propiedades de la molécula enzimática para lograr que desempeñe su función catalítica de manera óptima, en condiciones alejadas de las que prevalecen en su entorno fisiológico. Entre las múltiples metodologías dirigidas a superar una de las principales limitaciones del uso de las enzimas en procesos industriales –la estabilidad del biocatalizador– se encuentra la inmovilización de enzimas en soportes sólidos. En este sentido, los nanoarreglos de enzimas inmovilizadas en la superficie de nanopartículas constituyen un grupo de biocatalizadores inmovilizados de última generación, con propiedades biocatalíticas superiores a las de los derivados inmovilizados convencionales.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al ICP-CSIC (Madrid, España), al CO-NACyT (México) y a la Universidad de La Habana (Cuba) por el financiamiento de proyectos que han cubierto parte de esta investigación. Igualmente, expresamos agradecimiento al ICP-CSIC y al CQFMINSAP (La Habana, Cuba) por el suministro de muchos de los compuestos modelos presentados en este trabajo.

 

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