Kinetic characterization of recombinant PfAM1, a M1-aminopeptidase from Plasmodium falciparum (Aconoidasida: Plasmodiidae), using fluorogenic peptide substrates / Caracterización cinética de la PfAM1 recombinante, una aminopeptidasa M1 de Plasmodium falciparum (Aconoidasida: Plasmodiidae), con sustratos peptídicos fluorogénicos

Resumen

Plasmodium falciparum neutral M1-aminopeptidase (PfAM1) is a validated target against malaria, the main human parasitic disease in tropical regions. Recently, our group obtained a recombinant variant of this enzyme (rPfAM1) in Escherichia coli with a yield of 24 mg of active protein per L of culture. As a way to confirm the suitability of this recombinant aminopeptidase to be used as a target for the identification of new potent and selective inhibitors of the endogenous enzyme, and adjusting the experimental parameters of the inhibition assays, here we determined the main kinetic characteristics of rPfAM1 using L-aminoacyl-7-amido-4-methylcoumarin (AMC)-conjugated fluorogenic substrates. Firstly, the Zn2+ cation inhibited rPfAM1 activity at concentrations > 1 μmol/L, an effect qualitatively analogous to that observed for other metallo-aminopeptidases. In agreement with earlier reports, the near-neutral pH (7.2-7.4) is the optimum against the 4 substrates tested (Ala-, Leu-, Met- and Arg-AMC). The KM values at pH 7.2 (Met-AMC: 23 ± 5 μmol/L; Arg-AMC: 37 ± 4 μmol/L; Ala-AMC: 106 ± 9 μmol/L; Leu-AMC: 60 ± 7 μmol/L) are closer to those previously reported for the native enzyme than those described for another recombinant variant of PfAM1. On the other hand, the kcat values obtained here at pH 7.2 (Met-AMC: 99 ± 9 s-1; Arg-AMC: 129 ± 6 s-1; Ala-AMC: 268 ± 20 s-1; Leu-AMC: 79 ± 6 s-1) are the highest reported to date for PfAM1, indicating that our enzyme preparation is particularly active. Diminution of pH from 7.2 to 5.2, affected more the catalytic efficiency of rPfAM1 than affinity toward Leu-, Met- and Arg-AMC. The contrary effect was observed with Ala-AMC. The kinetic parameters at near-neutral pH varied as a function of the identity of the substrate amino-terminal residue, in a similar way to that reported by another group using natural dipeptide substrates against a third reported recombinant form of PfAM1. Finally, the rPfAM1 here obtained was not sensitive to the inhibitors PMSF, E64 and pep-statin A, but was inhibited by amastatin, 1,10-phenanthroline and bestatin. This is an inhibition profile typical of neutral and basic metallo aminopeptidases, also reported for native PfAM1. The obtainment of the kinetic parameters of rPfAM1 toward aminoacyl-AMC peptides will allow using these substrates to assess the inhibition of the endogenous enzyme on isolated live parasites.

Keywords: malaria, kinetic characterization, kinetic parameters, M1-family aminopeptidase, fluorogenic peptide substrates, AMC, Plasmodium falciparum, PfAM1

RESUMEN

La aminopeptidasa M1 neutra de Plasmodium falciparum (PfAM1) es un blanco validado contra la malaria, la principal enfermedad parasitaria humana en las regiones tropicales. Recientemente, nuestro grupo obtuvo una variante recombinante de esta enzima (PfAM1r) con un rendimiento de 24 mg de proteína activa por L de cultivo. Para confirmar la conveniencia de esta aminopeptidasa recombinante como blanco para la identificación de nuevos inhibidores potentes y selectivos de la enzima endógena, y para ajustar los parámetros experimentales de los ensayos de inhibición, en este trabajo se determinaron las principales características cinéticas de la PfAM1r frente a sustratos fluorogénicos conjugados L-aminoacil-7-amida-4-metilcumarina (AMC). En primer lugar, el catión Zn2+ inhibió la actividad de la PfAM1r a concentraciones > 1 μmol/L, un efecto análogo cualitativamente al observado para otras aminopeptidasas de tipo metalo. En correspondencia con informes anteriores, el pH cercano al neutro (7,2-7,4) es el óptimo con los 4 sustratos evaluados (Ala-, Leu-, Met- y Arg-AMC). Los valores de KM al pH 7,2 (Met-AMC: 23 ± 5 μmol/L; Arg-AMC: 37 ± 4 μmol/L; Ala-AMC: 106 ± 9 μmol/L; Leu-AMC: 60 ± 7 μmol/L) son más cercanos a los informados previamente para la enzima nativa que los obtenidos por otro grupo de autores con otra PfAM1 recombinante. Por otra parte, los valores de kcat obtenidos en este trabajo a pH 7,2 (Met-AMC: 99 ± 9 s-1; Arg-AMC: 129 ± 6 s-1; Ala-AMC: 268 ± 20 s-1; Leu-AMC: 79 ± 6 s-1) son los mayores informados hasta ahora para la PfAM1, lo que indica que la preparación enzimática obtenida es particularmente activa. La disminución del pH de 7,2 a 5,2, afectó más la eficiencia catalítica de la PfAM1r que la afinidad frente a la Leu-, Met- y Arg-AMC. El efecto contrario se observó con la Ala-AMC. Los parámetros cinéticos a valores de pH cercanos al neutro variaron en función de la identidad del residuo amino terminal del sustrato, de manera similar a lo infor-mado por otro grupo, los que utilizaron una tercera PfAM1 recombinante y sustratos dipéptidos naturales. Final-mente, la PfAM1r no resultó sensible a los inhibidores PMSF, E64 y pepstatina A, pero se inhibió por la amastati-na, la 1,10-fenantrolina y la bestatina. Este es un perfil de inhibición típico de aminopeptidasas de tipo metalo neutras y básicas, informado también para la PfAM1 nativa. La obtención de los parámetros cinéticos de la PfAM1r frente a los péptidos aminoacil-AMC permitirá el empleo de estos sustratos para evaluar la inhibición de la enzima endógena en parásitos vivos aislados.

Palabras clave: malaria, caracterización cinética, parámetros cinéticos, aminopeptidasa de la familia M1, sustratos peptídicos fluorogénicos, AMC, Plasmodium falciparum, PfAM1